利用近紅外標記和圖像及數據分析提高Cell Painting的可靠性
簡介
基于圖像的表型分析方法，如廣泛使用的 Cell Painting分析，使用高內涵成像和多參數輸出來研究細胞中的生物、遺傳和化學擾動。這種日益流行的方法正被應用于從藥物發(fā)現項目到基因組篩選研究。在標準的 Cell Painting 實驗中，各種細胞器和結構 ( 細胞核、細胞質、線粒體、高爾基體、內質網、細胞骨架、胞質 RNA 和核仁 ) 在 5 個成像通道中被采集。這種廣泛的細胞染色能夠以單細胞分辨率對多種形態(tài)的擾動進行監(jiān)測和定量。已發(fā)表的 Cell Painting 分析的局限性包括適合的染料可用性狹窄以及成像系統(tǒng)提供足夠的光譜分離能力。具體來說，高爾基體和肌動蛋白是通過同一通道成像的，這就給圖像分析中區(qū)分這兩個結構帶來了挑戰(zhàn)。這種限制可能會干擾 hit 的選擇或掩蓋某些化合物的效果，特別是那些具有影響高爾基體 ( 生物合成途徑 ) 或細胞骨架網絡的作用機制 (MOA) 的化合物。
優(yōu)勢
• 使用近紅外標記提高 Cell Painting 分析的靈敏度。
• 使用 IN Carta 的深度學習 SINAP 模塊獲得可靠的圖像分割。
• 結合 StratoMineR 的基于云的數據分析軟件易于使用。
在這里，我們試圖利用配備近紅外光源的 ImageXpressConfocal HT. ai 高內涵成像系統(tǒng)來改進檢測方法。我們將 Alexa Fluor 568 Phalloidin 替 換 為 Alexa Fluor 750Phalloidin，使細胞骨架與高爾基區(qū)域明顯分離。
由于這種多色分析的復雜性，從這些圖像分析中產生的龐大數據需要額外的分析工具來幫助挖掘和解釋數據。為了便于管理圖像和數據分析，我們使用 IN Carta 圖像分析軟件進行特征提取，然后使用 HC StratoMineR 進行數據挖掘和分析。IN Carta 具有深度學習功能，允許更可靠的特征分割。因此，當與深度學習的 SINAP 模塊一起使用時，Cell Painting 分析將受益于改進的細胞核檢測。此外，如線粒體、內質網、高爾基體和細胞骨架等細胞器可以在需要時使用深度學習功能進一步分割�？梢詮姆治龅�
圖像中提取包含熒光強度、空間數值、紋理、細胞器分布和共定位測量。然后將數據上傳到 HC StratoMineR，這是一個直觀的基于云的數據分析平臺，用于進一步的數據分析。為了確定我們的方法是否比標準的 Cell Painting方法有任何優(yōu)勢，我們比較了用 5 通道獲得的圖像和用 6通道獲得的圖像之間的表型距離得分。
我們發(fā)現，用一組化合物處理的細胞的距離得分提高了49%。這些結果表明，對高爾基體和細胞骨架使用單獨的成像通道增加了 Cell Painting 實驗的敏感性，并更有力的代表了不同的細胞表型特征。
方法
1. U2OS 細胞 (ATCC) 以每孔 2000 個細胞接種。
2.在四個復孔中，以 7 個數據點 1:3 系列稀釋和合適的對照品對 11 種化合物進行了測試。使用的化合
物 :Ca-074-Me、CCCP、氯喹、細胞松弛素 D、依托泊苷、拉春庫林 B、雷帕霉素、魚藤酮、十字孢堿、紫杉醇、粉防己堿。
3.細 胞 染 色 采 用 Bray 等 人 的 方 法1 。對 于 改 進 的 方案，使 用 phalloidin/Alexa Fluor Plus 750 (ThermoFisher) 代替 phalloidin/Alexa Fluor 568。
4.圖像采集在使用 20X Plan Apo 物鏡的 ImageXpressConfocal HT.ai ( 基于激光 ) 或者 ImageXpress MicroConfocal ( 基于 LED) 的高內涵成像系統(tǒng) (MolecularDevices) 上進行。 使用的濾光片如表 1 所示。
5.圖像分析采用 IN Carta 圖像分析軟件。所選擇的測量包括與強度、紋理、形狀、空間關系和共定位分數相關的參數。
6.細胞水平的數據被上傳到 StratoMineR (https://cla.stratominer.com/index.php, Core Life Analytics)進行進一步的數據分析。 簡要地說，采用了質量控制、孔歸一化、數據轉換和特征標準化。使用主成分分析(PCA) 對數據集進行降維。進一步的下游分析，如進行基于主成分和表型距離得分的 hit 選擇和聚類分析。
結果
圖像采集
Cell Painting 實驗使用六種熒光標記同時標記細胞，然后對各種細胞結構進行成像。高爾基體 ( AGP 通道 ) 和細胞骨架均使用相同的濾光片組成像 ( 表 1，圖 1 )。這些亞細胞結構的解析通常在圖像分析步驟中進行。在我們的模型實驗中，用 11 種化合物處理 U2OS 細胞 24 小時，然后再
根據之前發(fā)表的方法進行。1、2 然后使用 5 個成像通道對細胞進行成像 ( 圖 1 )。
為了從細胞骨架中分離出高爾基體結構，我們修改了檢測方法，將 Alexa Fluor 568 Phalloidin 換成 Alexa Fluor 750Phalloidin，并使用配備了近紅外光源的 ImageXpressConfocal HT. ai 高 內 涵 成 像 系 統(tǒng) 對 細 胞 進 行 成 像 ( 圖2A ) ( 以下簡稱改進的檢測 )。用這種方法，可以在未經處理的細胞中清楚地看到高爾基體結構在核周分布。當WGA( 高爾基體 ) 和鬼筆環(huán)肽 ( 肌動蛋白 ) 染色在同一通道成像時，這種分布不易區(qū)分 ( 圖 1 )。這種差異在化合物( 如粉防己堿 ) 處理的細胞中更為明顯 ( 圖 2B )。
圖 2 Cell Painting 實驗改進使用遠紅外光源的改良方案，以改善 Cell Painting 實驗中的光譜分離。 A)Phalloidin Alexa Fluor 750 用于在改良方案中標記肌動蛋白。顯示了來自對照孔的示例圖像。插圖 ( 白色框 ) 被放大，顯示為細胞核 ( 藍色 ) 和高爾基體通道 ( 黃色 ) 的合成圖。高爾基斑點明顯分布在核周組織中。B) 細胞用粉防己堿處理的圖像。左邊是肌動蛋白和高爾基體通道疊加的重建圖像 ( 黃色 )。右邊顯示只有高爾基體 ( 黃色 ) 和細胞核 ( 藍色 ) 的圖像。改良方案中粉防己堿對高爾基體分布的影響更為明顯 ( 右 )。C) 激光光源及其相對功率顯示。標示展示了各個光源檢測的細胞區(qū)域。
特征提取和數據分析
特征提取和數據分析
為了量化標準 cell paint 染料組與改良染料組染色的細胞之間的差異，在 IN Carta 圖像分析軟件中分析圖像 ( 圖3 )。提取的測量數據上傳到 HC StratoMineR 進行進一步的數據分析。從標準 Cell Painting 實驗與改良實驗提取的數據執(zhí)行主成分分析 (PCA)。有趣的是，AGP 通道的測量構成了 PCA 1 中 5 通道圖像的大部分特征成分。然而肌動蛋白通道的測量構成了 PCA 1 中改良后的 6 通道圖像的大部分主要特征 ( 圖 4 )。這表明，改進的分析方法可以提高肌動蛋白和高爾基體組分之間的表型圖譜的分辨率，這對了解 MOA 是有用的。
我們還根據距離評分比較了標準和改良 Cell Painting 實驗之間的表型特征。該分數表示一個樣本與陰性對照之間的表型距離，可用于篩選實驗中的 hit 選擇。我們發(fā)現已知影響高爾基體通路的化合物的距離分數有所增加( 表 2 )。這些結果表明，對高爾基體和細胞骨架使用單獨的成像通道增加了 Cell Painting 實驗的敏感性，并更有力地代表了細胞表型特征。
圖 3 在 IN Carta 軟件中進行特征提取，對各種細胞結構進行分割。在這里，內置的細胞核模型被用來在所有處理中實現核的穩(wěn)定分割。對于 6 通道采集的圖像，每個細胞提取 487 個特征。這里展示的是在 IN Carta 軟件中帶有特征掩模疊加的示例圖像。
圖 4 使用 HC StratoMineR 進行數據分析。A) HC StratoMineR 是一個基于網頁的平臺，引導用戶通過一個典型的工作流分析高內涵的多參數數據。B) 用 PCA( 廣義加權最小二乘法 ) 將數據減少到 15 個成分。特征對 PCA1 的貢獻顯示為一個極線圖。根據它們所代表的細胞區(qū)域，用特征顏色編碼。PCA1 特征從 5 通道 ( 上 ) 和 6 通道 ( 下 ) Cell Painting 采集。請注意特性的貢獻有所不同。
總結
•我們的結果表明，使用近紅外激光提高了 Cell Painting檢測的靈敏度。在這種情況下，它允許開發(fā)一種分離高爾基體表型更敏感的分析方法。
• 額外的通道還允許通過添加項目特定的生物標記物來擴展標準的 Cell Painting 分析。
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參考文獻
1. Bray MA et.al., Nat Protoc. 2016 Sep;11(9):1757–74.
2.Gustafsdottir SM et.al., PLoS One. 2013 Dec 2;8(12):e80999.
3.Omta WA, et.al., Assay Drug Dev Technol. 2016 Oct;14(8):439–452.
