快速、高通量的病毒中和抗體的檢測方法
簡介
新冠病毒的出現(xiàn)導致了世界范圍內的新冠大流行，為了理解病毒的發(fā)病機理并開發(fā)疫苗，亟需快速開發(fā)多種研究工具。檢測病毒感染和疫苗接種后的免疫反應對新冠病毒的研究十分重要。由于中和抗體是免疫反應和疫苗效價的關鍵生物標志物，患者血清樣本中的中和性抗體水平是用于監(jiān)測有效性的重要參數(shù)。
人體血清中和抗體的鑒定常使用傳統(tǒng)方法例如蝕斑減少中和試驗 (PRNT) 來檢測。然而，該方法使用活的、具備感染性的病毒加入到靶細胞中，所以需要生物安全三級實驗室以及耗時費力的細胞培養(yǎng)。數(shù)據(jù)結果的分析耗費時間并且不能自動化。此外，假病毒中和試驗 (pVNT) 方法使用改良型的病毒，可以在生物安全二級實驗室完成，但此方法需要細胞培養(yǎng)和熒光成像來測得中和抗體活性，因此，也不適用于樣品的高通量篩選。
此 GeneScript cPass 新冠病毒中和抗體檢測試劑盒采用免病毒中和測試法 (sVNT) 來克服傳統(tǒng)的病毒中和實驗的缺點。它采用酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA) 的模式，如圖 1 和圖 2 所示。
優(yōu)點
優(yōu)點
•快速、簡單的 ELISA 實驗流程設置
•無需三級實驗室或細胞培養(yǎng)
•實驗結果與蝕斑減少中和試驗數(shù)據(jù)一致
刺突蛋白受體結合區(qū)域的 HRP 偶聯(lián)片段與含有中和性抗體的患者血清樣本相結合。此混合物加入到已被 ACE2 受體包被的 ELISA 孔板中。如果樣品中的抗體有中和抗體的活性，那么 HRP-RBD 同 ACE2 的 結合將會被打破，隨后清洗，移除HRP-RBD。使用光吸收微孔板讀板機測量產生的信號，在中和抗體存在的情況下，此信號會更低，將此信號與實驗對照組的信號進行比較，可以評估待測樣本中存在的中和抗體活性。
在此替代的病毒中和實驗 (sVNT) 試 劑盒的數(shù)據(jù)結果，由SpectraMax 微孔 板讀 板機 進 行檢 測、SoftMax Pro 軟件進行分析得到。這些結果與先前使用的傳統(tǒng)假病毒中和試驗(pVNT) 方法得到的結果密切相關，然而只需要一小部分地時間和更低的生物實驗室安全等級限制。
圖 1 對比 PRNT 和 sVNT 試劑盒的操作流程。sVNT 實驗方法能在二級實驗室中 1 小時內完成，而 PRNT 需要活的新冠病毒以及繁瑣的細胞培養(yǎng)技術，在三級實驗室中也要兩天多的時間。
圖 2 新冠病毒 sVNT 檢測方法。此實驗使用 ELISA 模式，在待測樣本中通過中和性的抗體能夠檢測 RBD 與 ACE2 結合的擾動。
材料
• GenScript cPass 新冠病毒中和抗體檢測試劑盒 (GenScript cat. #L00847-A)，
• 10 份血清樣本，已經通過 PRNT (Corgenix) 方法證實中和抗 體陽性，
• 3 份血清樣本，已經通過 PRNT (Corgenix) 方法證實中和抗體陰性，
• MultiWash+ 微孔板洗板機 (Molecular Devices)
• 光吸收檢測模式用到的 Molecular Devices 酶標儀：
• SpectraMax ABS Plus 酶標儀
• SpectraMax iD5 多功能酶標儀
• SpectraMax i3x 多功能酶標儀
• SpectraMax M5e 多功能酶標儀
在實驗開始前，試劑盒的所有組分和待測樣本可放置于室溫。試劑盒中的試劑需要按如下操作稀釋：
• 用去離子水稀釋 20x 儲液得到 1x wash，
• 用 HRP 稀釋緩沖液按 1:1000 比例稀釋 HRP-RBD 儲液得到HRP-RBD 工作液。
待測樣本 和實驗對照組分別與 HRP 偶聯(lián)的 RBD 混合，并按如下操作孵育。待測樣本、陽性對照、陰性對照，分別用樣品稀釋緩沖液按 1:10 比例稀釋，例如：12uL 待測樣品 + 108uL緩沖液。將稀釋后的樣品和對照組分別與等量的 HRP-RBD 工作液混合在不同的試管中，例如：120uL HRP-RBD 工作液 +
待測樣本 和實驗對照組分別與 HRP 偶聯(lián)的 RBD 混合，并按如下操作孵育。待測樣本、陽性對照、陰性對照，分別用樣品稀釋緩沖液按 1:10 比例稀釋，例如：12uL 待測樣品 + 108uL緩沖液。將稀釋后的樣品和對照組分別與等量的 HRP-RBD 工作液混合在不同的試管中，例如：120uL HRP-RBD 工作液 +
120uL 稀釋后的待測樣品或對照品。此混合物在 37 度孵育15 分鐘。
分別添加 100uL 的陽性對照混合物、陰性對照混合物、待測樣品混合物至實驗復孔中。然后封蓋，在 37 度孵育 15 分鐘。
使 用 MultiWash+ 洗 板機 和 1x wash 溶 液 清 洗 所有 的 微 孔板，每次每孔 300 uL，橫向吸液。然后，100uL TMB 溶液加入到每個孔中，封蓋，避光，室溫孵育 15 分鐘。
與 TMB 底物孵育后，50 uL 終止溶液加入到每個孔中，立即在多款酶標儀上測讀，光吸收波長設置為 450 nm。實驗結果的有效性評估看陰性對照的 OD450 值是否大于 1.0，陽性對照的值是否小于 0.3。如果不符合這些標準，實驗結果無效，需要重復試驗。各個待測樣本的百分比抑制值按如下公式計算：
表 1 的卡值被用來說明樣本的結果是陽性還是陰性，是否存在可檢測到的新冠中和抗體。表中的卡值來源于新冠 sVNT試劑盒手冊。對于不同地區(qū)和種族背景，使用者可以直接基于具有代表性的患者血清樣本設置卡
表 1 抑制性卡值大小用于說明實驗結果。
結果
使用陽性和陰性對照評估實驗結果的質量。如表 2 所示，陰性對照的 OD450 值大于 1.0，陽性對照的 OD450 值小于 0.3，這是根據(jù) sVNT 試劑盒的質量控制要求而定。
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表 2，陰性對照的 OD450 值大于 1.0，陽性對照的 OD450 值小于 0.3，驗證了實驗結果。對照組做一次重復實驗，變異系數(shù) CV 值小于 30% 是可重現(xiàn)的。
如方法中所描述，待測樣本和陰性對照的 OD450 值用于計算百分比抑制值�；谠噭┖惺謨灾幸话愕目ㄖ堤攸c，百分比抑制值大于等于 30% 說明檢測到新冠中和抗體，呈陽性；百分比抑制值小于 30% 說明未檢測到新冠中和抗體，呈陰性。在PRNT 中和活性檢測中呈陰性的三個樣品，在 sVNT 檢測中也呈陰性。同樣地，在 PRNT 中和活性檢測中呈陽性的十個樣品，在 sVNT 檢測中也呈陽性 ( 如表 3)。
結論
表 3 先前測得的多個樣品的百分比抑制值和陽性、陰性結果。使用SpectraMax ABS Plus 獲得表中所示的實驗結果，其他類型的酶標儀也獲得相同的結果。
結論
此 GenScript cPass 新冠病毒中和抗體檢測試劑盒數(shù)據(jù)來源于一組患者血清樣本，與傳統(tǒng)的、耗時費力的 PRNT 方法獲得的數(shù)據(jù)吻合。此 sVNT 試劑盒提供了易于使用的試劑和緊湊的 ELISA 工作流程，大約 1 小時能夠完成。其中必需的一步清洗操作由MultiWash+ 洗板機完成，節(jié)約了寶貴的時間。SpectraMax 讀板機和 SoftMax Pro 軟件產生的數(shù)據(jù)能夠運用實驗特異的方案進行分析，設置公式可以應用于所需的計算和自動結果輸出。
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參考文獻
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Nature 586, 594–599 (2020).
3. SARS-CoV-2 surrogate Virus Neutralization Test (sVNT) Kit Manual (cat. #L00847).
