熒光二抗甄選擇的方法介紹
在生物醫(yī)學(xué)研究中，熒光標(biāo)記技術(shù)因其高靈敏度和特異性而被廣泛應(yīng)用于各種實(shí)驗(yàn)中，如細(xì)胞成像、蛋白質(zhì)定位、流式細(xì)胞術(shù)等。熒光二抗（熒光標(biāo)記的二抗）是其中一種關(guān)鍵的試劑，其選擇方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。
1、如何選擇熒光基團(tuán)?
在選擇用于科學(xué)研究的熒光基團(tuán)時(shí)，主要考慮熒光基團(tuán)組合的設(shè)計(jì)。在用于多重檢測實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇彼此兼容的熒光基團(tuán)組合以及檢測和分析它們的儀器是至關(guān)重要的。
（1）建議使用明亮的熒光基團(tuán)(如PE, Alexa Fluor®488)檢測弱表達(dá)的靶標(biāo)，而不太明亮的熒光基團(tuán)(如FITC)可用于檢測大量表達(dá)的靶標(biāo)；
（2）考慮每個(gè)熒光基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射光譜，最大限度地減少光譜重疊和避免背景干擾也很重要；根據(jù)儀器具有的激光激發(fā)波長和檢測通道選擇合適的熒光基團(tuán)；
（3）另外選擇光譜不與內(nèi)源熒光重疊的熒光基團(tuán)，檢查未染色的標(biāo)本以確定樣品是否顯示自身熒光。
（4）另一個(gè)策略是確認(rèn)多個(gè)熒光二抗組合時(shí)產(chǎn)生的熒光信號(hào)與單個(gè)熒光抗體相同；這將排除由于不同抗體混合在一起而產(chǎn)生的交叉反應(yīng)或阻斷效應(yīng)。可以用單個(gè)熒光抗體作為對(duì)照。
（5）另外，所有的熒光基團(tuán)都應(yīng)該妥善儲(chǔ)存，遠(yuǎn)離光線。到保質(zhì)期的試劑應(yīng)該與新試劑一起測試，以確保亮度不受影響。一些熒光基團(tuán)可能對(duì)常見的固定和滲透緩沖液敏感，在實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。某些熒光基團(tuán)可能與某些細(xì)胞類型或結(jié)構(gòu)非特異性結(jié)合，雖然封閉液可以防止這種情況，在和其他熒光基團(tuán)一起使用時(shí)需要檢查。
2、抗體特異性
理想的熒光二抗應(yīng)具有高度特異性，能夠特異性識(shí)別目標(biāo)抗原，避免非特異性結(jié)合。這不僅有助于提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，還能減少背景噪聲。在選擇熒光二抗時(shí)，應(yīng)仔細(xì)查閱產(chǎn)品說明書，了解其特異性和交叉反應(yīng)情況。Jackson提供超2000種的預(yù)吸附二抗，可以最大程度地消除了特點(diǎn)物種之間交叉反應(yīng)，適合用于多標(biāo)記的IF/IHC/ICC實(shí)驗(yàn)，并可獲得更低的背景值。
3、抗體濃度
熒光二抗的濃度直接影響熒光信號(hào)的強(qiáng)度和背景噪聲。過高的抗體濃度可能增加非特異性結(jié)合，導(dǎo)致背景噪聲增加；而過低的抗體濃度則可能使信號(hào)強(qiáng)度不足。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳抗體濃度，以獲得最佳的熒光信號(hào)。
4、抗體形式
在研究某些細(xì)胞和組織時(shí)（如白細(xì)胞群體：巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等；某些組織：淋巴結(jié)，脾臟，外周血等），這些細(xì)胞或組織因表面Fc端受體過多，會(huì)與抗體分子中的Fc端相結(jié)合，從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合和高背景的現(xiàn)象（如下圖所示），俗稱“假陽性”。
使用F(ab')₂ 形式的二抗可以避免其與活細(xì)胞中的Fc受體非特異性結(jié)合，從而提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。
5、反應(yīng)種屬
熒光二抗的反應(yīng)種屬應(yīng)和一抗的宿主來源一致，如果是多標(biāo)熒光實(shí)驗(yàn)，多個(gè)二抗的宿主來源最好一致，并且建議選擇預(yù)吸附二抗以減少交叉反應(yīng)。
Jackson ImmunoResearch Inc.（JIR）是世界著名二抗生產(chǎn)商，致力于生產(chǎn)親和純化的二抗金標(biāo)準(zhǔn)品牌。
Jackson熒光二抗的優(yōu)勢：
1. 高靈敏度，線性范圍廣；
2. 高稀釋比，性價(jià)比高；
3. 高特異性：10種特異性，包括IgG(H+L)、IgG Light Chain、IgG F(ab’)2、IgG VHH、IgG Fc、IgG + IgM、IgA + IgG + IgM、IgM、IgA和IgE；
4. 種屬豐富：16種種屬，包括小鼠、大鼠、人、兔、綿羊、羊駝、牛、貓、雞、狗、山羊、綿羊、豚鼠、馬、倉鼠、豬；
5. 標(biāo)記豐富：從藍(lán)光到近紅外光譜范圍（400 nm~1400 nm）內(nèi)，涵蓋了19種不同的熒光標(biāo)記染料，分辨率高并且儀器兼容性廣；
6. 穩(wěn)定性好：親和純化二抗，光耐受性（抗淬滅性）強(qiáng)，水溶性好，儲(chǔ)存不會(huì)產(chǎn)生沉淀，pH值不敏感；
7. 可消除物種之間的交叉反應(yīng)：Jackson提供超2000種的預(yù)吸附二抗，可以最大程度地消除了特點(diǎn)物種之間交叉反應(yīng)，適合用于多標(biāo)記的IF/IHC/ICC實(shí)驗(yàn)，并可獲得更低的背景值。（產(chǎn)品名稱min X后的物種已驗(yàn)證過不會(huì)交叉反應(yīng)）。
1、如何選擇熒光基團(tuán)?
在選擇用于科學(xué)研究的熒光基團(tuán)時(shí)，主要考慮熒光基團(tuán)組合的設(shè)計(jì)。在用于多重檢測實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇彼此兼容的熒光基團(tuán)組合以及檢測和分析它們的儀器是至關(guān)重要的。
（1）建議使用明亮的熒光基團(tuán)(如PE, Alexa Fluor®488)檢測弱表達(dá)的靶標(biāo)，而不太明亮的熒光基團(tuán)(如FITC)可用于檢測大量表達(dá)的靶標(biāo)；
（2）考慮每個(gè)熒光基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射光譜，最大限度地減少光譜重疊和避免背景干擾也很重要；根據(jù)儀器具有的激光激發(fā)波長和檢測通道選擇合適的熒光基團(tuán)；
（3）另外選擇光譜不與內(nèi)源熒光重疊的熒光基團(tuán)，檢查未染色的標(biāo)本以確定樣品是否顯示自身熒光。
（4）另一個(gè)策略是確認(rèn)多個(gè)熒光二抗組合時(shí)產(chǎn)生的熒光信號(hào)與單個(gè)熒光抗體相同；這將排除由于不同抗體混合在一起而產(chǎn)生的交叉反應(yīng)或阻斷效應(yīng)。可以用單個(gè)熒光抗體作為對(duì)照。
（5）另外，所有的熒光基團(tuán)都應(yīng)該妥善儲(chǔ)存，遠(yuǎn)離光線。到保質(zhì)期的試劑應(yīng)該與新試劑一起測試，以確保亮度不受影響。一些熒光基團(tuán)可能對(duì)常見的固定和滲透緩沖液敏感，在實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。某些熒光基團(tuán)可能與某些細(xì)胞類型或結(jié)構(gòu)非特異性結(jié)合，雖然封閉液可以防止這種情況，在和其他熒光基團(tuán)一起使用時(shí)需要檢查。
2、抗體特異性
理想的熒光二抗應(yīng)具有高度特異性，能夠特異性識(shí)別目標(biāo)抗原，避免非特異性結(jié)合。這不僅有助于提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，還能減少背景噪聲。在選擇熒光二抗時(shí)，應(yīng)仔細(xì)查閱產(chǎn)品說明書，了解其特異性和交叉反應(yīng)情況。Jackson提供超2000種的預(yù)吸附二抗，可以最大程度地消除了特點(diǎn)物種之間交叉反應(yīng)，適合用于多標(biāo)記的IF/IHC/ICC實(shí)驗(yàn)，并可獲得更低的背景值。
3、抗體濃度
熒光二抗的濃度直接影響熒光信號(hào)的強(qiáng)度和背景噪聲。過高的抗體濃度可能增加非特異性結(jié)合，導(dǎo)致背景噪聲增加；而過低的抗體濃度則可能使信號(hào)強(qiáng)度不足。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳抗體濃度，以獲得最佳的熒光信號(hào)。
4、抗體形式
在研究某些細(xì)胞和組織時(shí)（如白細(xì)胞群體：巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等；某些組織：淋巴結(jié)，脾臟，外周血等），這些細(xì)胞或組織因表面Fc端受體過多，會(huì)與抗體分子中的Fc端相結(jié)合，從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合和高背景的現(xiàn)象（如下圖所示），俗稱“假陽性”。
使用F(ab')₂ 形式的二抗可以避免其與活細(xì)胞中的Fc受體非特異性結(jié)合，從而提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。
5、反應(yīng)種屬
熒光二抗的反應(yīng)種屬應(yīng)和一抗的宿主來源一致，如果是多標(biāo)熒光實(shí)驗(yàn)，多個(gè)二抗的宿主來源最好一致，并且建議選擇預(yù)吸附二抗以減少交叉反應(yīng)。
Jackson ImmunoResearch Inc.（JIR）是世界著名二抗生產(chǎn)商，致力于生產(chǎn)親和純化的二抗金標(biāo)準(zhǔn)品牌。
Jackson熒光二抗的優(yōu)勢：
1. 高靈敏度，線性范圍廣；
2. 高稀釋比，性價(jià)比高；
3. 高特異性：10種特異性，包括IgG(H+L)、IgG Light Chain、IgG F(ab’)2、IgG VHH、IgG Fc、IgG + IgM、IgA + IgG + IgM、IgM、IgA和IgE；
4. 種屬豐富：16種種屬，包括小鼠、大鼠、人、兔、綿羊、羊駝、牛、貓、雞、狗、山羊、綿羊、豚鼠、馬、倉鼠、豬；
5. 標(biāo)記豐富：從藍(lán)光到近紅外光譜范圍（400 nm~1400 nm）內(nèi)，涵蓋了19種不同的熒光標(biāo)記染料，分辨率高并且儀器兼容性廣；
6. 穩(wěn)定性好：親和純化二抗，光耐受性（抗淬滅性）強(qiáng)，水溶性好，儲(chǔ)存不會(huì)產(chǎn)生沉淀，pH值不敏感；
7. 可消除物種之間的交叉反應(yīng)：Jackson提供超2000種的預(yù)吸附二抗，可以最大程度地消除了特點(diǎn)物種之間交叉反應(yīng)，適合用于多標(biāo)記的IF/IHC/ICC實(shí)驗(yàn)，并可獲得更低的背景值。（產(chǎn)品名稱min X后的物種已驗(yàn)證過不會(huì)交叉反應(yīng)）。
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