文獻(xiàn)信息
同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院施劍林院士團(tuán)隊(duì)及其附屬上海市第十人民醫(yī)院骨科等團(tuán)隊(duì)的研究成果Hydrolysis of 2D Nanosheets Reverses Rheumatoid Arthritis Through Anti-Inflammation and Osteogenesis (2D納米片原位水解通過抗炎和成骨治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎) 在學(xué)術(shù)期刊《ADVANCED MATERIALS》 (IF：27.4) 上發(fā)表。平生公司的離活一體CT (NEMO) 在論文中提供了重要的小鼠踝關(guān)節(jié)、兔子膝關(guān)節(jié)圖像和定量分析結(jié)果。

該論文的通訊作者為同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院霍敏鋒研究員和吳鵬副教授，第一作者為同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院冀鵬豪博士生。

文獻(xiàn)摘要
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種關(guān)節(jié)功能障礙的炎癥疾病。臨床上，針對(duì)RA的藥物僅側(cè)重于減輕局灶性炎癥，而不考慮骨微環(huán)境的促成骨重建。在本研究中，通過簡(jiǎn)單的液相剝離制備了二維層狀二硅化鈣納米片(CSNs)。CSNs的水解產(chǎn)生抗氧化H₂、堿性Ca(OH)₂和二氧化硅。這些部分在抗氧化、抗炎和促骨生成中起著重要作用，導(dǎo)致比單獨(dú)抗炎更好的RA治療效果。氫氣被證實(shí)可以消除過量的羥基自由基并調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的再極化；生成的Ca(OH)₂可以中和酸性微環(huán)境并抑制破骨細(xì)胞活性；而且，溶解的Ca²⁺可以有效地與磷酸鹽復(fù)合，礦化成Ca₃(PO₄)₂，促進(jìn)病灶關(guān)節(jié)的成骨。

實(shí)驗(yàn)方法
佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（AIA）小鼠和兔模型
20只雌性Balb/c小鼠（6周齡）隨機(jī)分為四組（N=5）。第一組被選為對(duì)照組，不進(jìn)行任何治療。另一組在小鼠右后踝關(guān)節(jié)注射25μL CFA，建立AIA模型。同時(shí)，左后踝關(guān)節(jié)注射相同體積的PBS。每三天用游標(biāo)卡尺記錄踝關(guān)節(jié)的寬度。計(jì)算右關(guān)節(jié)與左關(guān)節(jié)的寬度比，以評(píng)估關(guān)節(jié)腫脹程度。

 為了建立AIA兔模型，將20只兔子隨機(jī)分為四組（N=5）。第一組被選為對(duì)照組，不進(jìn)行任何治療。其他組通過反復(fù)注射卵清蛋白（OVA）和CFA進(jìn)行免疫接種。簡(jiǎn)而言之，將OVA溶解在PBS（20 mg mL^-1）中，并與等體積的CFA混合。然后在4°C下將混合物完全乳化。每周在背部皮下的五個(gè)部位注射1mL乳液對(duì)兔子進(jìn)行免疫接種，持續(xù)3周。在第三周和第四周，將混合的OVA/CFA乳液注射到雙側(cè)膝關(guān)節(jié)中（每膝0.5mL），以誘導(dǎo)AIA兔模型。
 AIA小鼠關(guān)節(jié)炎治療的體內(nèi)評(píng)估：三組AIA小鼠（N=5）分別關(guān)節(jié)內(nèi)注射25μL PBS或等體積含CSNs（3 mg kg⁻¹）或DMP（10 mg kg⁻¹）的PBS。每3天測(cè)量一次體重和踝關(guān)節(jié)寬度。評(píng)估3周后，處死所有小鼠并收集踝關(guān)節(jié)組織。通過RT-PCR分析評(píng)估促炎細(xì)胞因子（TNF-α和IL-6）和抗炎細(xì)胞因子（CD206和IL-10）的水平，并通過顯微CT（平生醫(yī)療科技有限公司）掃描評(píng)估組織形態(tài)計(jì)量學(xué)。還量化了關(guān)節(jié)的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)（Tb.Sp和Tb.BMD）。
 

AIA兔關(guān)節(jié)炎治療的體內(nèi)評(píng)估：三組AIA兔（N=5）分別關(guān)節(jié)內(nèi)注射500μL PBS或等體積含CSNs（3mg kg⁻¹）或DMP（10mg kg^−L）的PBS。每三天測(cè)量一次體重和踝關(guān)節(jié)寬度。1周內(nèi)兩次給藥后，通過MRI記錄膝關(guān)節(jié)的病理過程。評(píng)估期結(jié)束后，處死關(guān)節(jié)炎兔和正常兔，收集膝關(guān)節(jié)組織。通過ELISA評(píng)估促炎細(xì)胞因子（TNF-α和IL-6）和抗炎細(xì)胞因子（IL-10）的蛋白質(zhì)水平。通過顯微CT（平生醫(yī)療科技有限公司）掃描評(píng)估組織形態(tài)計(jì)量學(xué)，并量化關(guān)節(jié)的組織形態(tài)計(jì)量參數(shù)（Tb、Sp和Tb、BMD）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
采用佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（AIA）方法建立RA小鼠模型。具體來說，雌性Balb/c小鼠在右后踝關(guān)節(jié)內(nèi)注射完全弗氏佐劑（CFA），然后免疫5天，導(dǎo)致關(guān)節(jié)明顯腫脹（圖6a；）。將15只關(guān)節(jié)炎小鼠隨機(jī)分為三組（N=5），關(guān)節(jié)內(nèi)注射PBS或等體積的含CSN或地塞米松磷酸鈉（DMP，臨床批準(zhǔn)的藥物）的PBS。另取5只未注射佐劑的健康小鼠作為對(duì)照組。DMP治療組的小鼠體重略有下降，而其他組的小鼠在評(píng)估期的27天內(nèi)體重沒有明顯波動(dòng)，這可能是由于DMP的副作用造成的（圖6c）。在對(duì)照組和DMP治療組的小鼠中觀察到可忽略或中等的治療效果。CSNs組踝關(guān)節(jié)腫脹明顯減輕（圖6b）。在治療終點(diǎn)拍攝的照片清楚地顯示，與對(duì)照組和DMP組相比，CSNs組的踝關(guān)節(jié)腫脹明顯減輕，與聯(lián)合測(cè)量結(jié)果一致（圖6d）。顯微CT掃描圖像顯示，與正常組相比，關(guān)節(jié)炎組小鼠的踝關(guān)節(jié)有明顯的骨侵蝕。CSNs和DMP均顯著改善了骨侵蝕，驗(yàn)證了CSNs的高療效（圖6e）。基于顯微CT分析的骨微觀結(jié)構(gòu)的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)，如小梁骨礦物質(zhì)密度（Tb.BMD）和小梁間距（Tb.Sp），表明CSN治療后RA關(guān)節(jié)的骨顯微結(jié)構(gòu)與健康關(guān)節(jié)相似，這歸因于CSN的強(qiáng)大抗炎和促生物礦化作用（圖6f，g）。

圖6. CSNs對(duì)AIA小鼠抗RA療效的評(píng)價(jià)。a） 小鼠AIA模型建立和治療方案的示意圖。b） c）受不同治療的小鼠的體重曲線。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（N=5）。d） 不同組別小鼠踝關(guān)節(jié)的代表性照片。e） 在第27天，來自不同組的小鼠右踝關(guān)節(jié)的代表性3D重建顯微CT圖像。第27天不同組小鼠右踝關(guān)節(jié)骨微觀結(jié)構(gòu)的組織形態(tài)學(xué)顯微CT分析[f）Tb.BMD和g）Tb.Sp]。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（N=4）。h） mRNA（IL-6、IL-10、TNF-α、TNF-α）的相對(duì)表達(dá)，CD206）。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（N=4）。i） 不同組別小鼠右踝關(guān)節(jié)的代表性H&E染色、賽峰紅固定綠染色、ALP和TRAP染色圖像。

顯微CT分析的結(jié)果提供了股骨脛骨軟骨下骨結(jié)構(gòu)的信息（圖7e）。從不同角度（如冠狀面、正中矢狀面和橫斷面）對(duì)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行計(jì)算重建，清楚地表明RA組兔子的股骨脛骨軟骨下骨受到侵蝕。CSN治療通過抗炎和釋放生物礦化物質(zhì)（無定形磷酸鈣和二氧化硅）逆轉(zhuǎn)了兔子的RA進(jìn)展。DMP對(duì)家兔的抗炎治療和RA逆轉(zhuǎn)作用效果有限。股骨脛骨軟骨下骨微觀結(jié)構(gòu)的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)，如Tb.BMD和Tb.Sp用于定量分析RA關(guān)節(jié)的骨微觀結(jié)構(gòu)（圖7f，g）。與顯微CT重建圖像一致，由于CSN具有強(qiáng)大的抗炎和探針礦化作用，CSN治療后的骨參數(shù)與健康關(guān)節(jié)的骨參數(shù)相似。

圖7.CSNs對(duì)AIA兔抗RA療效的評(píng)價(jià)。a）兔AIA模型建立和治療方案示意圖。b）不同組別家兔膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)的時(shí)間依賴性。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（N=5）。c） 紅外熱成像圖像和d）不同組別兔子膝關(guān)節(jié)的焦點(diǎn)溫度。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（N=5）。e）在第70天，不同組別兔子膝關(guān)節(jié)的代表性3D重建顯微CT圖像。不同組別兔膝關(guān)節(jié)骨微觀結(jié)構(gòu)的組織形態(tài)計(jì)量顯微CT分析[f）Tb.BMD和g）Tb.Sp]。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（N=3）。h）TNF-α，i） IL-6和j）在第70天從不同組的兔關(guān)節(jié)獲得的滑液的IL-10。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（N=3）。

使用結(jié)論
總之，通過簡(jiǎn)單的液相剝離方法成功合成了2D納米片CSN，通過其水解產(chǎn)物——抗氧化/抗炎H₂氣體和堿性Ca(OH)₂治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，這些產(chǎn)物抑制破骨細(xì)胞活性，并通過CSN中的Ca²⁺溶解促進(jìn)CAP礦化實(shí)現(xiàn)促成骨作用。制備的CSN尺寸為280nm，RA的酸性微環(huán)境會(huì)加速水解反應(yīng)，水解產(chǎn)生的Ca²⁺原位礦化成CAP促進(jìn)骨修復(fù)。CSNs的抗氧化、抗炎、促成骨和抗破骨的作用在體外得到驗(yàn)證。從機(jī)制上講，病灶的巨噬細(xì)胞的復(fù)極化在CSNs治療RA中起著關(guān)鍵作用，這是通過納米材料產(chǎn)生的氫氣消耗過量ROS和恢復(fù)炎癥穩(wěn)態(tài)來實(shí)現(xiàn)的，機(jī)制上來說，主要是抑制NF-κB和MAPK信號(hào)通路的過度激活來實(shí)現(xiàn)。在AIA小鼠和兔模型中，合成的CSNs在抗炎和骨礦化方面表現(xiàn)出優(yōu)異的生物安全性和治療性能。作者的工作開發(fā)了一種精細(xì)的層狀CSNs納米藥物，不僅可以抑制炎癥，而且具備骨修復(fù)和軟骨恢復(fù)功能，為對(duì)抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎提供了基本的理解和可轉(zhuǎn)化的策略。

使用設(shè)備

                                  Micro CT (型號(hào)：NEMO) (平生醫(yī)療科技)

                                          影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）