在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，了解微觀世界的奧秘對(duì)于攻克疾病、探索生命本質(zhì)至關(guān)重要。光學(xué)成像技術(shù)作為重要的研究手段，不斷推陳出新。其中，新型多光子成像技術(shù)近年來(lái)發(fā)展迅猛，為科研人員和醫(yī)療工作者提供了更為強(qiáng)大的觀測(cè)工具。它能夠深入活體組織內(nèi)部，獲取高分辨率的圖像，幫助我們窺探細(xì)胞和組織的細(xì)微結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)變化。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
傳統(tǒng)光學(xué)成像的局限
傳統(tǒng)光學(xué)成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷中發(fā)揮了重要作用，但也存在諸多局限性。例如，在觀察深層組織時(shí)，光的散射和吸收會(huì)導(dǎo)致成像質(zhì)量下降，分辨率降低，難以清晰呈現(xiàn)組織內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)。而且，傳統(tǒng)成像技術(shù)可能對(duì)組織造成較大的光損傷，影響細(xì)胞的正常生理功能，干擾研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。這些局限限制了我們對(duì)生物體內(nèi)復(fù)雜過(guò)程的深入理解，迫切需要新的成像技術(shù)來(lái)突破這些瓶頸。

多光子成像技術(shù)的興起
隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，多光子成像技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。它基于多光子吸收原理，與傳統(tǒng)成像技術(shù)相比，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。多光子成像能夠有效減少光散射和吸收，降低組織光損傷，提高成像的信噪比，并且具備良好的光學(xué)層析成像能力，為生物醫(yī)學(xué)研究帶來(lái)了新的希望。接下來(lái)，我們將詳細(xì)介紹幾種新型多光子成像技術(shù)。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
微型化雙光子熒光成像技術(shù)
技術(shù)原理與發(fā)展歷程：微型化雙光子熒光成像技術(shù)是為滿足對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)在體研究的需求而發(fā)展起來(lái)的。神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，研究其活動(dòng)需要在盡量保持其完整性的情況下進(jìn)行成像。雙光子熒光成像利用近紅外光激發(fā)，具有深組織穿透性、光學(xué)切片能力以及較小的光毒性和光漂白等優(yōu)勢(shì)，成為無(wú)創(chuàng)在體腦顯微成像的首選。第一臺(tái)微型化雙光子顯微鏡原型機(jī)于2001年問(wèn)世，采用單模光纖尖端掃描，但存在質(zhì)量重、掃描頻率受限和難以批量生產(chǎn)等問(wèn)題。2006年，微機(jī)電系統(tǒng)（MEMS）掃描鏡被引入，一定程度上改善了性能，但仍存在無(wú)法對(duì)重要熒光探針成像和實(shí)際工作性能不佳等問(wèn)題。

攜帶式雙光子顯微鏡
最新進(jìn)展與優(yōu)勢(shì)：北京大學(xué)程和平課題組報(bào)道的高速高分辨微型化雙光子顯微鏡（FHIRM-TPM）代表了該技術(shù)的最新進(jìn)展。它采用MEMS掃描鏡設(shè)計(jì)，對(duì)配件進(jìn)行改進(jìn)和創(chuàng)新，這款顯微鏡重量?jī)H2.15g，橫向分辨率和軸向分辨率分別提升約一倍，能有效激發(fā)常用熒光指示劑，可在小鼠活躍運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定工作。

應(yīng)用領(lǐng)域：微型化雙光子顯微鏡主要用于腦成像，能夠在動(dòng)物自由活動(dòng)狀態(tài)下研究神經(jīng)活動(dòng)，為神經(jīng)科學(xué)研究提供了有力工具。未來(lái)，它有望拓展應(yīng)用于更多組織成像，通過(guò)更換物鏡適應(yīng)不同成像需求，還可與微創(chuàng)方法結(jié)合實(shí)現(xiàn)更深層腦成像，或借助新興三光子技術(shù)提升成像效果。

雙光子光纖內(nèi)窺成像技術(shù)
技術(shù)優(yōu)勢(shì)與分類：雙光子光纖內(nèi)窺成像技術(shù)為早期癌癥局部微創(chuàng)診斷提供了新途徑。雙光子激發(fā)只發(fā)生在焦點(diǎn)附近，激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)，散射更少，能穿透更深標(biāo)本，提高圖像對(duì)比度，還可通過(guò)分析非線性信號(hào)了解內(nèi)部器官生理、病理變化。該技術(shù)的內(nèi)窺鏡按光纖類型分為單模光纖（SMF）、光子晶體光纖（PCF）和雙包層光纖（DCF）。單模光纖最早應(yīng)用，但存在脈沖變寬和難以收集非線性信號(hào)的缺點(diǎn)。光子晶體光纖能提高激發(fā)光束傳遞和非線性信號(hào)采集效率，雙包層光纖便于實(shí)現(xiàn)內(nèi)窺鏡微型化。

掃描裝置與發(fā)展成果：研究者通過(guò)改良掃描裝置提高成像速度和質(zhì)量，多種微型掃描機(jī)構(gòu)已被應(yīng)用。隨著技術(shù)發(fā)展，雙光子內(nèi)窺成像在科研和臨床應(yīng)用中取得較大進(jìn)展，如對(duì)癌細(xì)胞成像、大腦深部成像、上皮組織成像以及對(duì)大鼠食管組織和尾腱成像等。

最新進(jìn)展與應(yīng)用前景：2017年，Liang WX等人實(shí)現(xiàn)了具有亞細(xì)胞層次分辨率的光纖內(nèi)窺平臺(tái)，可對(duì)活體內(nèi)生物組織進(jìn)行無(wú)標(biāo)記雙光子代謝成像。該裝置在光纖、物鏡和激發(fā)效率等方面進(jìn)行改進(jìn)，提高了檢測(cè)靈敏度、空間分辨率和圖像質(zhì)量，整體信噪比提高20-50倍。它能夠監(jiān)測(cè)急性小鼠腎缺血再灌注體內(nèi)模型中腎皮質(zhì)小管的氧化還原率變化，展現(xiàn)了高分辨率和高靈敏度。未來(lái)，雙光子光纖內(nèi)窺成像技術(shù)將朝著提高成像速度和信噪比的方向發(fā)展，在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用也將更加廣泛。

三光子成像技術(shù)
發(fā)展歷程與原理：三光子成像技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了漫長(zhǎng)過(guò)程。研究者們很早就觀察到三光子吸收激發(fā)熒光現(xiàn)象，1979年Catalano等人對(duì)無(wú)機(jī)材料的三光子非線性光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行定量分析，1995年Davey等人在有機(jī)高分子聚合物溶液中觀察到三光子激發(fā)熒光現(xiàn)象并提出應(yīng)用設(shè)想。隨后，一系列研究驗(yàn)證了三光子成像的能力，但受光源技術(shù)和成本限制，發(fā)展較為緩慢。直到2013年，Horton等人報(bào)道了使用基于孤子自頻移（SSFS）光源的三光子顯微鏡，使三光子成像取得重要突破。

與雙光子成像的比較：與雙光子成像相比，三光子成像使用波長(zhǎng)更長(zhǎng)的激發(fā)光源，成像深度更大。這是因?yàn)殚L(zhǎng)波激發(fā)光在組織中的散射更低，且1600-1800nm的激發(fā)光可避開組織中水對(duì)紅外光的吸收峰。同時(shí)，三光子吸收需要更高激光能量，能進(jìn)一步削弱非焦平面的背景信號(hào)，提高信號(hào)-背景比（SBR），獲得更高質(zhì)量圖像。不過(guò)，三光子成像也存在缺陷，如對(duì)高能激發(fā)光需求導(dǎo)致設(shè)備成本和技術(shù)難度增加，強(qiáng)激光可能對(duì)組織造成損傷。

應(yīng)用領(lǐng)域與發(fā)展方向：目前，三光子成像主要應(yīng)用于活體組織高分辨成像和光遺傳學(xué)研究等領(lǐng)域，未來(lái)有望應(yīng)用于臨床光學(xué)治療。為克服現(xiàn)有缺陷，研究人員正通過(guò)開發(fā)新型熒光染料、尋找合適激光光源和優(yōu)化探測(cè)器等方法，提高三光子成像深度、分辨率和信號(hào)強(qiáng)度。

成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
微型化雙光子顯微鏡的成像實(shí)驗(yàn)
微型化雙光子顯微鏡（如FHIRM-TPM）在腦成像實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出色。在對(duì)小鼠的研究中，它能夠清晰捕捉小鼠活躍運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下神經(jīng)元的活動(dòng)情況。通過(guò)有效激發(fā)熒光，科研人員可以觀察到神經(jīng)元的形態(tài)和功能變化，為研究神經(jīng)回路的動(dòng)態(tài)過(guò)程提供了直觀的數(shù)據(jù)。與傳統(tǒng)臺(tái)式雙光子顯微鏡相比，F(xiàn)HIRM-TPM的高分辨率和高掃描速度，使其能夠更精準(zhǔn)地記錄神經(jīng)元活動(dòng)的時(shí)空信息，有助于深入理解神經(jīng)系統(tǒng)的工作機(jī)制。

雙光子光纖內(nèi)窺成像實(shí)驗(yàn)
雙光子光纖內(nèi)窺成像技術(shù)在生物組織代謝成像方面成果顯著。以對(duì)急性小鼠腎缺血再灌注體內(nèi)模型的研究為例，通過(guò)無(wú)標(biāo)記雙光子內(nèi)窺技術(shù)監(jiān)測(cè)腎皮質(zhì)小管的氧化還原率變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血時(shí)NADH濃度增加，氧化還原比下降，再灌注后恢復(fù)正常。從成像圖像中可以清晰看到，缺血后紅色區(qū)域氧化還原比下降，再灌注后紅色區(qū)域變成綠色，直觀展示了雙光子內(nèi)窺顯微成像的高分辨率和高靈敏度，為研究腎臟生理病理過(guò)程提供了有力依據(jù)。

三光子成像實(shí)驗(yàn)
三光子成像技術(shù)在大腦成像實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。使用基于SSFS光源的三光子顯微鏡對(duì)小鼠大腦進(jìn)行成像，可以無(wú)損地看到大腦灰質(zhì)之下的白質(zhì)。與雙光子成像相比，三光子成像能夠穿透更深的組織，獲得更清晰的深層結(jié)構(gòu)圖像。在對(duì)神經(jīng)元和腦血管的成像中，三光子成像的高SBR使得圖像中的細(xì)節(jié)更加豐富，有助于研究人員深入了解大腦的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，為神經(jīng)科學(xué)研究開辟了新的視角。

總結(jié)與展望
新型多光子成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域意義重大。微型化雙光子成像技術(shù)讓科學(xué)家能在動(dòng)物自由活動(dòng)時(shí)研究神經(jīng)系統(tǒng)，為解開大腦奧秘提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)，推動(dòng)神經(jīng)科學(xué)發(fā)展，未來(lái)有望拓展到更多組織成像，幫助理解多種生理病理過(guò)程。雙光子內(nèi)窺成像技術(shù)可實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)的體內(nèi)檢測(cè)，提高疾病早期診斷準(zhǔn)確性，降低患者痛苦和醫(yī)療成本，未來(lái)提高成像速度和信噪比后，將在臨床廣泛應(yīng)用，助力疾病早篩和精準(zhǔn)治療。三光子成像技術(shù)憑借大成像深度和高SBR，在研究深層組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能方面優(yōu)勢(shì)明顯，隨著技術(shù)完善，有望為臨床光學(xué)治療提供新方法，提高治療效果。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
石玉潔, 張廣杰, 陸政元, 應(yīng)亞宸, 賈薈琳, 席鵬. 新型多光子成像技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)光學(xué)（中英文）, 2018, 11(3): 296-306. 
DOI:10.3788/CO.20181103.0296.