如何隨心所欲的做好免疫組化？

免疫組化（Immunohistochemistry) 至今也有八十余年的歷史了，從 1930 年免疫組化的理論被提出討論，一直到 1941 年以帶有熒光色素的抗體，成功地觀(guān)察到組織中肺炎雙球菌抗原的存在，至此之后不斷對(duì)于方法改良創(chuàng)新，也就形成了我們實(shí)驗(yàn)中才使用的免疫組化這門(mén)技術(shù)，先來(lái)淡談一下免疫組化為何八十幾年來(lái)還是都是實(shí)驗(yàn)室中的重要的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之一。

人體的器官是由最小單位細(xì)胞所組成的，一般實(shí)驗(yàn)不論是從細(xì)胞研究蛋白或是基因，我們往往都會(huì)想知道通過(guò)最小單位的細(xì)胞放大到組織后，我們所研究的蛋白或是基因會(huì)是以何種方式的呈現(xiàn)在組織上呢？這時(shí)不論是研究蛋白 (免疫組化 Immunohistochemistry) 或是研究基因（原位雜交法 chromogenicin situ hybridization，CISH) 就不難理解這兩門(mén)技術(shù)的重要性了。

我們首先針對(duì)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行討論，一般做組化的同仁一定會(huì)遇到的頭痛問(wèn)題，這個(gè)問(wèn)題也就是背景 (background)，背景的產(chǎn)生來(lái)至四面八方，從組織前處理，抗原修復(fù)，免疫阻斷到最后呈色，以上這些都是有可能會(huì)造成背景的產(chǎn)生，所以到此撇開(kāi)人為因素不談，我們慎選一組好的免疫組化的套組對(duì)整體的實(shí)驗(yàn)是非常的重要。

我們一一的來(lái)討論背景是如何產(chǎn)生的，從組織前處理來(lái)說(shuō)，我們最開(kāi)始取得組織，我們會(huì)經(jīng)過(guò)一個(gè)步驟(灌流)，為何要灌流呢？我們首先要知道我們免疫組化最常使用的方法就是 HRP 呈色。那我們把鏡頭拉回我們的組織，我們要知道組織中富含最多 HRP 的就是我們的血球，從這邊大概就可以知道我們?nèi)绻麤](méi)有把血球處理干凈的話(huà),很容易造成在后續(xù)呈色的時(shí)候，會(huì)發(fā)現(xiàn)血球沒(méi)有清除干凈的地方就會(huì)產(chǎn)生我們所謂的背景了，另一個(gè)也是清除組織里面血球的方法，也就是我們免疫組化中一定會(huì)使用的過(guò)氧化酶去除劑，以上這兩個(gè)方法都是有效去除我們組織上面的 HRP。

另一個(gè)步驟也是組化實(shí)驗(yàn)中一定會(huì)使用到但是往往會(huì)忽略的一步：抗原修復(fù)，為什么要做抗原修復(fù)呢？原因是我們?nèi)〉眯迈r檢體時(shí)通常都會(huì)進(jìn)行甲醛固定這個(gè)步驟，而甲醛固定的這個(gè)過(guò)程中會(huì)形成醛鍵，醛鍵是會(huì)封閉抗原的決定族，這種化合物封閉了抗原，一但抗原被封閉后，我們?cè)谶M(jìn)行抗體接合時(shí)，就會(huì)因?yàn)榭贵w無(wú)法辨識(shí)抗原因而造成偽陰性的情況，這也就是為什么要做抗原修復(fù)的原因，抗原修復(fù)的方法有很多種，目前最常使用的有以下三種檸檬酸緩沖液（Citrate），EDTA緩沖液，酵素（Enzyme），通常我們最常使用的是檸檬酸緩沖液，主要是它可以進(jìn)行的抗原修復(fù)抗原的種類(lèi)涵蓋的比較廣，但是還是會(huì)有一些抗原的位置是檸檬酸緩沖液無(wú)法處理的，所以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇對(duì)的抗原修復(fù)液，也是很重要的一門(mén)功課。

再來(lái)談到在實(shí)驗(yàn)中會(huì)使用的免疫阻斷劑，免疫阻斷劑的配方有很多種，但是其實(shí)每一種配方可能只能針對(duì)特定的背景進(jìn)行去除，這時(shí)選擇復(fù)合性的免疫阻斷劑會(huì)對(duì)于實(shí)驗(yàn)更有幫助，其實(shí)我們會(huì)發(fā)現(xiàn)大部分進(jìn)行組化實(shí)驗(yàn)的時(shí)候?yàn)槭裁炊际且岳鲜蠡蚴峭米拥臋z體背景最多呢？其實(shí)這個(gè)問(wèn)題不難回答，我們翻翻自己冰箱的抗體,大多數(shù)的物種就是來(lái)自于老鼠或是兔子，也因?yàn)檫@個(gè)緣故而造成在進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)會(huì)有背景的產(chǎn)生，所以免疫阻斷劑的選擇變成整體實(shí)驗(yàn)非常大的一個(gè)關(guān)鍵。

最后我們討論到的呈色，不過(guò)這個(gè)跟實(shí)驗(yàn)法則比較相關(guān)了，我們所使用的 DAB 或是 AEC 呈色，他們的原理是以沉淀的方式進(jìn)行顯色，這也意味著我們呈色的實(shí)驗(yàn)越長(zhǎng)顏色就會(huì)越深，所以對(duì)于呈色的時(shí)間點(diǎn)拿捏也是完成整個(gè)免疫組化非常重要的一個(gè)課題。

綜合以上討論的項(xiàng)目，做組化并不困難，其實(shí)魔鬼藏在細(xì)節(jié)里，我們只要針對(duì)每個(gè)環(huán)節(jié)每個(gè)可能產(chǎn)生背景的部分更細(xì)心去進(jìn)行處理，免疫組化就是一項(xiàng)很簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)了。

再來(lái)我們討論一項(xiàng)我們進(jìn)行免疫組織染色實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中會(huì)遇到的問(wèn)題，一般我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)要研究的蛋白絕對(duì)不會(huì)有一種，我們一定會(huì)看各式各樣的蛋白讓我們研究主題這個(gè)故事更完整，但是一般我們進(jìn)行組化只能染一種可見(jiàn)光的顏色，那如果我們想同時(shí)觀(guān)察兩種蛋白在組織上面是相互抑制或是相互增長(zhǎng)等等的表現(xiàn)，我們勢(shì)必會(huì)使用一種染色方法 (雙染 Double stain)，相信雙染在座的各位一定也不陌生，但是你們熟悉的往往都是熒光的雙染，這時(shí)就會(huì)有疑問(wèn)了，為什么只能做熒光呢？主要是熒光雙染我們是可以利用激發(fā)光的不同分開(kāi)來(lái)拍攝，最后再進(jìn)行圖片的合成，但是這也衍生出其它的問(wèn)題來(lái)，第一個(gè) 蛋白的位置，我們最開(kāi)始使用免疫組化不就是為了想看我們研究的蛋白是在什么地方表現(xiàn)的嗎？但是如果使用熒光染色就會(huì)明白只有我們蛋白表現(xiàn)的位置會(huì)發(fā)光，而其它的部分全都是黑的，這么一來(lái)其實(shí)就很難去討論它表現(xiàn)在組織的位置是否是正確的，另一個(gè)問(wèn)題 照片的合成，我們以雙染來(lái)探討，我們會(huì)先拍 DAPI 也就是核的部分，再來(lái)是我們研究的　A 蛋白　跟 B 蛋白，整個(gè)拍完之后再利用軟件進(jìn)行合成，第一點(diǎn)時(shí)間會(huì)耗費(fèi)很久，第二點(diǎn)是合成的時(shí)候萬(wàn)一背景沒(méi)有處理的很干凈因而產(chǎn)生一些非專(zhuān)一性結(jié)合的表現(xiàn)，這時(shí)同時(shí)使用三張圖片合成一張，這個(gè)結(jié)果圖可能會(huì)變得非常不好進(jìn)行數(shù)據(jù)的判斷。

其實(shí)大家心里會(huì)有一個(gè)疑問(wèn)，為什么不做可見(jiàn)光呢？其實(shí)依照以前的技術(shù)是真的比較不好進(jìn)行可見(jiàn)光的雙染，主要還是因?yàn)榭梢?jiàn)光的免疫組化同時(shí)看兩種抗體如果沒(méi)處理好反而會(huì)有很臟的背景，相信有想做的同仁一定都遇過(guò)上述的問(wèn)題，不過(guò)近年來(lái)隨著技術(shù)跟方法的提升，我們已經(jīng)突破會(huì)造成背景的問(wèn)題了，如此一來(lái)針對(duì)上述熒光所帶來(lái)的問(wèn)題，例如我們想在同一個(gè)視野下看到兩種蛋白的表現(xiàn)還有沒(méi)有背景的產(chǎn)生，通通會(huì)因?yàn)橛羞@項(xiàng)新的技術(shù)迎刃而解了，以前進(jìn)行雙染有些時(shí)候是沒(méi)辦法做可見(jiàn)光才進(jìn)行熒光的，不過(guò)這個(gè)問(wèn)題已經(jīng)解決，相信可見(jiàn)光的免疫組化雙染，這個(gè)新技術(shù)可以為大家的研究更上一層樓。

最后要為大家介紹是最近研究非常熱門(mén)的技術(shù)（原位雜交法chromogenicin situ hybridization，CISH）這個(gè)技術(shù)說(shuō)新其實(shí)也不新，早在 20 世紀(jì) 80 年代末就開(kāi)始發(fā)展這門(mén)技術(shù)，不過(guò)當(dāng)時(shí)所研究的重點(diǎn)都放在 DNA 上，但是也因?yàn)榧夹g(shù)門(mén)坎高加上成功率也不那么的穩(wěn)定，造成這門(mén)技術(shù)我們?cè)跁?shū)上�？吹降�是實(shí)際應(yīng)用其實(shí)不廣，那么為什么會(huì)說(shuō)是最近開(kāi)始熱門(mén)起來(lái)呢？其一、隨著生物科技產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，技術(shù)與學(xué)術(shù)不斷推陳出新，早期遇到的問(wèn)題都可以輕易破解，其二最近微小 RNA（Micro RNA）變成了一個(gè)主流的研究方向，早期我們不斷的研究著蛋白的表現(xiàn)路徑，隨著學(xué)術(shù)知識(shí)不斷的更新，我們從下游產(chǎn)物蛋白質(zhì)不斷的往上追尋，終于找到了比較前面的源頭也就是微小 RNA，最早我們利用實(shí)時(shí)PCR（Realtime PCR）來(lái)進(jìn)行測(cè)定，但是測(cè)定出來(lái)的結(jié)果都是一長(zhǎng)串的數(shù)據(jù)分析，人的求知欲是無(wú)限的，隨著研究時(shí)間越久人們的求知欲越高，于是回到最一開(kāi)始我們提到的問(wèn)題，如果有辦法在組織上看到微小 RNA 的表現(xiàn)不知道會(huì)是什么情形呢，就是這個(gè)想法讓原本沉寂已久的原位雜交法瞬間變成了學(xué)術(shù)及研究界中的新星，這個(gè)方法滿(mǎn)足了我們所有的求知欲，隨著技術(shù)改進(jìn)，原位雜交法實(shí)驗(yàn)步驟變得容易，研究的方向從最早的 DNA，RNA 到最近的微小 RNA 都可以進(jìn)行研究，而另一個(gè)更好的優(yōu)點(diǎn)則是她并不受蛋白質(zhì)裂解的影響，綜合以上優(yōu)點(diǎn)不難理解為什么大家爭(zhēng)先恐后的要使用這門(mén)技術(shù)了。

組織研究是在學(xué)術(shù)研究上不可抹滅及取代的一塊研究領(lǐng)域，我們將病理組織相關(guān)研究技術(shù)不斷的研究及推陳出新，一直秉持著走在研究技術(shù)的最前端，在將來(lái)我們要把目前最火紅的兩門(mén)技術(shù)原位雜交法及免疫組化雙染同時(shí)進(jìn)行在同一個(gè)組織上，也就是意味著我們一個(gè)組織可以同時(shí)看到基因的表現(xiàn)也可以同時(shí)觀(guān)察到蛋白質(zhì)的表現(xiàn)，相信這門(mén)新興的技術(shù)會(huì)再一次把病理組織這門(mén)技術(shù)推上更高的巔峰。

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