你是否在為計(jì)數(shù)尺寸較小的PBMC、T細(xì)胞等而發(fā)愁？
在篩選用于輸血的紅細(xì)胞時(shí)，為避免免疫反應(yīng)，對(duì)不同細(xì)胞類型進(jìn)行區(qū)分尤為重要，而臺(tái)盼藍(lán)無(wú)法區(qū)分，這一問(wèn)題該如何解決？
本文提供了使用熒光染料、借助高通量熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀快速準(zhǔn)確對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)、鑒別的方式。

吖啶橙（AO）等熒光染料可以更準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)血液樣本中的白細(xì)胞，這是一項(xiàng)有助于對(duì)抗血癌的創(chuàng)新方法。
血癌——包括淋巴瘤、白血病和骨髓瘤，通常難以治療。傳統(tǒng)的化療和放療療效有限，特別是在復(fù)發(fā)或?qū)χ委熡械挚沟那闆r下容易引起嚴(yán)重的副作用。
最近出現(xiàn)的新療法，特別是嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞療法，有希望解決這些復(fù)雜的疾病。CAR-T細(xì)胞療法包括提取患者自身的免疫T細(xì)胞，對(duì)它們進(jìn)行基因工程改造靶向癌細(xì)胞，然后將它們重新引入患者體內(nèi)。
這種方法在治療血癌方面取得了顯著的成功。然而，要使CAR-T細(xì)胞療法充分發(fā)揮其潛力，臨床醫(yī)生需要了解每個(gè)樣品中免疫細(xì)胞的準(zhǔn)確數(shù)量和質(zhì)量。
 
自動(dòng)計(jì)數(shù)
位于韓國(guó)首爾的一家名為NanoEntek的公司于2000年代初期開(kāi)始研究可行的解決方案。該公司的研究人員探索了微流控技術(shù)對(duì)改善血液樣本細(xì)胞計(jì)數(shù)的潛力。
傳統(tǒng)方法使用臺(tái)盼藍(lán)染料，該染料僅染色死細(xì)胞。病理學(xué)家通過(guò)手動(dòng)計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，然后減去染色死細(xì)胞的數(shù)量來(lái)確定細(xì)胞活力。
然而，這種方法是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的。NanoEnTek意識(shí)到需要更好的解決方案，于是開(kāi)發(fā)了使用自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法。通過(guò)引入自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，該公司使該過(guò)程更加一致、準(zhǔn)確，并操作簡(jiǎn)便。此外，通過(guò)使用自動(dòng)化高通量細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，顯著提高了細(xì)胞計(jì)數(shù)的效率。
 

細(xì)胞鑒別
隨著技術(shù)的進(jìn)步，傳統(tǒng)方法的可靠性越來(lái)越低。這體現(xiàn)在進(jìn)行細(xì)胞治療研究時(shí)，原代細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞 （PBMC） 和干細(xì)胞等多種細(xì)胞類型的計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確。
例如，臺(tái)盼藍(lán)的顯著局限性是它無(wú)法區(qū)分紅細(xì)胞和PBMC。在篩選用于輸血的紅細(xì)胞時(shí)，對(duì)不同細(xì)胞類型進(jìn)行區(qū)分尤為重要，因?yàn)榘准?xì)胞的存在可能會(huì)引起受者的免疫反應(yīng)。
熒光染料如AO和DAPI通過(guò)選擇性染色細(xì)胞核來(lái)克服這一限制。因此，這可以幫助研究人員和臨床醫(yī)生輕松區(qū)分具有細(xì)胞核的白細(xì)胞和缺乏細(xì)胞核的紅細(xì)胞。
此外，手動(dòng)計(jì)數(shù)難以對(duì)體積小的血細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。熒光染料可以克服這個(gè)問(wèn)題，因?yàn)樗鼈冞x擇性地對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，并在顯微鏡下觀察時(shí)發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。因此，它們甚至可以更精準(zhǔn)地測(cè)量最小的細(xì)胞，如PBMC、T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，這些細(xì)胞對(duì)細(xì)胞治療至關(guān)重要。
此外，NanoEnTek的多幀成像技術(shù)可以進(jìn)一步提高測(cè)量精度。“自動(dòng)成像系統(tǒng)可以對(duì)每個(gè)樣本都采集到多張圖像，”NanoEnTek的Chan Park解釋道，“由于所有測(cè)量值都是平均的，因此精度得到了顯著提高。”
 
解決復(fù)雜問(wèn)題
在處理含有污染物的樣品或可能患有污染物的患者的樣品時(shí)，基于熒光的方法非常有效。
準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)細(xì)胞和基因治療至關(guān)重要，正在使用NanoEnTek的熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的公司InnoBation Bio的 Beom Choi 說(shuō)：“準(zhǔn)確的活淋巴細(xì)胞數(shù)量是材料質(zhì)控的一個(gè)簡(jiǎn)單而重要的標(biāo)準(zhǔn)，”他解釋道，“如果初始密度測(cè)量不正確，一切都會(huì)分崩離析。”
免疫系統(tǒng)被激活而導(dǎo)致炎癥是傳統(tǒng)方法的挑戰(zhàn)。這可能導(dǎo)致淋巴細(xì)胞樣本被大量紅細(xì)胞污染，傳統(tǒng)方法可能會(huì)錯(cuò)誤地將其計(jì)為淋巴細(xì)胞。“然而，由于紅細(xì)胞缺乏細(xì)胞核，它們不會(huì)吸收熒光染料，”Choi解釋說(shuō)，“這使我們能夠準(zhǔn)確地確定起始材料中活細(xì)胞的數(shù)量。”
冷凍是病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常見(jiàn)做法，同樣面臨著挑戰(zhàn)。
使用傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)會(huì)低估解凍后的死細(xì)胞數(shù)量。
美國(guó)德克薩斯州休斯頓衛(wèi)理公會(huì)研究所的生物醫(yī)學(xué)工程教授Moonsoo Jin目前正在評(píng)估NanoEnTek的一種免疫表型分析儀器。他熱衷于基于熒光的方法提高精度的能力，特別是在經(jīng)歷多次凍融循環(huán)的細(xì)胞治療產(chǎn)品中。
“基于熒光的自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)滿足了對(duì)細(xì)胞準(zhǔn)確且快速地計(jì)數(shù)，并能獲得細(xì)胞治療中需要的細(xì)胞活力的相關(guān)數(shù)據(jù)，通常需要在制造和產(chǎn)品發(fā)布過(guò)程中多次凍融”，Jin指出，“NanoEnTek的儀器只需要少量樣品，就可以提供準(zhǔn)確和快速的細(xì)胞數(shù)量和活力結(jié)果。”
這種準(zhǔn)確性、高效率和小樣本量的結(jié)合凸顯了基于熒光的細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)在細(xì)胞治療中的顯著優(yōu)勢(shì)。
 

展望
NanoEnTek擴(kuò)展了這種基于熒光的技術(shù)，不僅旨在區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，還要區(qū)分各種類型的免疫細(xì)胞。這一進(jìn)展與用于治療血癌的CAR-T細(xì)胞療法（同時(shí)使用T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞）相關(guān)。正如Park所指出的，其目標(biāo)是擴(kuò)展細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的功能，以涵蓋免疫表型分析，以適應(yīng)基于細(xì)胞療法不斷變化的需求。
基于這些創(chuàng)新，NanoEnTek開(kāi)發(fā)了能夠同時(shí)處理多達(dá) 48 個(gè)樣品的自動(dòng)化的高通量細(xì)胞計(jì)數(shù)儀——EVE™ HT FL高通量熒光自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。此外，與傳統(tǒng)方法相比，它需要的樣本量要少得多。這對(duì)于CAR-T細(xì)胞療法等研究尤其有利，因?yàn)镃AR-T細(xì)胞療法只有少量可用于各種評(píng)估。“NanoEnTek將自動(dòng)化系統(tǒng)的速度和準(zhǔn)確性與熒光染料的特異性結(jié)合在一個(gè)設(shè)備中，”Park說(shuō)，“這有望改善細(xì)胞分析，為提高生物醫(yī)學(xué)研究和治療的精度鋪平道路。”
“隨著細(xì)胞治療和基因治療的不斷擴(kuò)展，從血癌擴(kuò)展到實(shí)體瘤，基于熒光的細(xì)胞染色方法的應(yīng)用進(jìn)一步蓬勃發(fā)展，有望在更廣泛的治療環(huán)境中發(fā)揮作用。