mRNA m5C修飾的鑒定、效應(yīng)分子、分子機(jī)制及其生理病理功能深度綜述
5-甲基胞嘧啶（m5C）是一種在轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）和核糖體RNA（rRNA）中廣泛存在的核酸修飾，同時(shí)也在轉(zhuǎn)錄組中廣泛分布，是真核生物信使RNA（mRNA）的內(nèi)部修飾之一。越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)了m5C在mRNA中的存在。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，尤其是亞硫酸鹽測(cè)序（bisulfite sequencing）的應(yīng)用，m5C修飾在轉(zhuǎn)錄組中的分布和功能逐漸被揭示，人們對(duì)其在mRNA中的分子機(jī)制和生物學(xué)意義有了一定的初步認(rèn)識(shí)。本文旨在全面總結(jié)m5C在mRNA中的鑒定與篩選、分布、分子功能和生物學(xué)功能的最新研究進(jìn)展，并概述當(dāng)前研究現(xiàn)狀，展望其未來(lái)潛在應(yīng)用前景。
m5C修飾的鑒定和分布
m5C修飾已在多種RNA種類(lèi)中被鑒定，包括核糖體RNA（rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）、信使RNA（mRNA）、增強(qiáng)子RNA（eRNA），并且最近還在長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）、環(huán)狀RNA（circRNA）和微小RNA（miRNA）中檢測(cè)到m5C修飾。m5C修飾的研究最初集中在tRNA和rRNA上，而對(duì)mRNA的研究則相對(duì)滯后。然而近年來(lái)，用于檢測(cè)m5C修飾的高通量技術(shù)發(fā)展迅速，例如亞硫酸鹽測(cè)序（BS-seq）、5-氮雜胞苷交聯(lián)測(cè)序（Aza-IP）或單核苷酸分辨率交聯(lián)免疫沉淀測(cè)序（miCLIP-seq）。特別是超快速亞硫酸氫鹽測(cè)序（UBS-seq）和m5C-TAC-seq等新技術(shù)的出現(xiàn)，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性。由于上述高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)在可以確定細(xì)胞RNA中m5C的整體分布情況。與DNA不同，mRNA m5C修飾相對(duì)較少，且由于其低豐度和高背景噪聲，對(duì)轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的m5C圖譜進(jìn)行繪制在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性。
B. 不同的RNA亞硫酸鹽測(cè)序分析流程用于鑒定mRNA中的m5C位點(diǎn)。Cs：未甲基化的胞嘧啶。
通過(guò)利用RNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化與基于SOLiD技術(shù)的全轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序相結(jié)合，首次以單堿基分辨率獲得了轉(zhuǎn)錄組中胞嘧啶修飾的高分辨率視圖。采用預(yù)定義的選擇標(biāo)準(zhǔn)，在mRNA序列中鑒定出8495個(gè)新的候選m5C位點(diǎn)，顯示出m5C在mRNA非翻譯區(qū)（UTR）和近Argonaute蛋白結(jié)合區(qū)域富集。
隨后，BS-seq轉(zhuǎn)向利用Illumina技術(shù)，并已在多種生物和條件下應(yīng)用，不同研究采用不同的選擇標(biāo)準(zhǔn)來(lái)篩選潛在的m5C候選位點(diǎn)。其中一項(xiàng)研究利用BS-seq在人類(lèi)HeLa細(xì)胞和多種小鼠組織中繪制了轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的m5C圖譜，鑒定出1955個(gè)mRNA上的5065個(gè)m5C位點(diǎn)，揭示了mRNA m5C位點(diǎn)的中位甲基化水平約為20.5%，與mRNA假尿苷化程度相似。在這些位點(diǎn)的分布特征方面，m5C修飾主要位于編碼序列（CDS）中，主要在CG環(huán)境中，以及mRNA翻譯起始位點(diǎn)的下游區(qū)域。在小鼠組織樣本的m5C測(cè)序中，觀察到它們顯示出與小鼠和人類(lèi)HeLa細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的中位甲基化水平和m5C分布模式相似的結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)表明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞mRNA中，m5C的分布模式具有高度的保守性。進(jìn)一步的研究揭示了不同小鼠組織和睪丸發(fā)育過(guò)程中m5C修飾的分布，表明了哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組中m5C修飾的保守性、組織特異性和動(dòng)態(tài)特征。
另一項(xiàng)研究關(guān)注了小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）和大腦中總和核poly(A) RNA的表觀轉(zhuǎn)錄組中胞嘧啶甲基化的全面圖譜，觀察到m5C位點(diǎn)在翻譯起始密碼子附近（如5'UTR末端和CDS起始處）有顯著積累，在編碼序列中耗竭，并在3'UTR中有混合的富集模式。通過(guò)比較ESCs和大腦組織中的甲基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)ESCs中有57%的甲基化位點(diǎn)在大腦組織中未甲基化。此外，這些差異甲基化通常不由差異表達(dá)引起，表明mRNA中的胞嘧啶甲基化可能以高度細(xì)胞和組織特異性的方式發(fā)生，與轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平無(wú)關(guān)。
然而，不同研究中估計(jì)的mRNA m5C位點(diǎn)數(shù)量差異很大，觀察結(jié)果不一致，難以定義一組通用的mRNA底物或常見(jiàn)的甲基化目標(biāo)序列。隨后，mRNA中m5C的研究轉(zhuǎn)向了更嚴(yán)格的位點(diǎn)鑒定。Rui Zhang等人開(kāi)發(fā)了一種計(jì)算流程，以準(zhǔn)確識(shí)別mRNA m5C位點(diǎn)，涵蓋了與轉(zhuǎn)化效率、覆蓋率和截止標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)。隨后，多個(gè)研究采用了這一工作流程。
圖2：m5C的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法示意圖。
A. 在RNA BS-seq中，亞硫酸鹽處理將未修飾的胞嘧啶脫氨基為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則保持不變。
B. 5-氮雜胞苷（5-aza-C）是一種胞嘧啶類(lèi)似物，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，RNA聚合酶會(huì)隨機(jī)將其摻入到初生（nascent ）RNA轉(zhuǎn)錄本的胞嘧啶位點(diǎn)。在m5C-RCMT催化結(jié)構(gòu)域中，半胱氨酸殘基的硫原子與目標(biāo)RNA堿基的C6位置形成共價(jià)鍵。隨后，通過(guò)甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的作用，目標(biāo)胞嘧啶的C5位置發(fā)生甲基化。在C5甲基化后，通過(guò)后續(xù)的β-消除反應(yīng)斷裂共價(jià)鍵，從而恢復(fù)自由酶。由于5-氮雜胞苷中C5位置的碳原子被氮原子（N）取代，共價(jià)鍵得以穩(wěn)定，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性酶的耗竭，從而使RNA和DNA的甲基化水平降低。
C. 在甲基化過(guò)程中，保守的半胱氨酸殘基Cys1暫時(shí)與甲基化胞嘧啶形成共價(jià)鍵，而第二個(gè)半胱氨酸Cys2對(duì)于這種催化中間體的分解至關(guān)重要。在miCLIP中，Cys2突變?yōu)楸彼幔ˋla），便于捕獲催化中間體，并允許甲基轉(zhuǎn)移酶與內(nèi)源性RNA靶標(biāo)發(fā)生交聯(lián)，而無(wú)需光交聯(lián)。最終，這些交聯(lián)的表位標(biāo)記的酶-底物復(fù)合體得以形成。
D. 從機(jī)制上講，BS-seq中存在兩條競(jìng)爭(zhēng)性途徑：一條實(shí)現(xiàn)從C到U的期望轉(zhuǎn)化，另一條則導(dǎo)致不期望的DNA/RNA降解。超快速BS測(cè)序方法（UBS-seq）使用高濃度亞硫酸鹽（約10M）和98°C的高反應(yīng)溫度，通過(guò)縮短反應(yīng)時(shí)間來(lái)減少RNA降解，并提高反應(yīng)溫度以實(shí)現(xiàn)完全的C到U轉(zhuǎn)化。
E. 在m5C-TAC-seq中，m5C被氧化為f5C，隨后用1,3-茚二酮（AI）的疊氮衍生物進(jìn)行標(biāo)記。這一過(guò)程通過(guò)生物素拉下來(lái)富集含有m5C的RNA，并在m5C位點(diǎn)誘導(dǎo)C到T的轉(zhuǎn)化。
總之研究表明，m5C修飾在mRNA中的分布具有一定的規(guī)律性。它主要集中在編碼序列（CDS）區(qū)域，尤其是在mRNA翻譯起始位點(diǎn)附近的區(qū)域。此外，m5C修飾在不同組織和細(xì)胞類(lèi)型中表現(xiàn)出保守性、組織特異性和動(dòng)態(tài)性。例如，在小鼠和人類(lèi)細(xì)胞中，m5C修飾的分布模式高度保守。
m5C修飾的效應(yīng)分子
m5C修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，涉及三種主要的調(diào)控效應(yīng)分子：甲基轉(zhuǎn)移酶（“writers”）、去甲基化酶（“erasers”）和結(jié)合蛋白（“readers”）。
B. NSUN2和NSUN6在tRNA和mRNA上偏好的修飾位點(diǎn)示意圖。NSUN2靶向甲基化人類(lèi)中絕大多數(shù)tRNA的特定位點(diǎn)（C48、C49和C50）。NSUN6特異性地靶向帶有UCCA尾的tRNAThr和tRNACys的3'端C72位點(diǎn)。NSUN2依賴(lài)的位點(diǎn)傾向于包含m5CNGG motif，并且位于5'端。NSUN6主要催化II型m5C位點(diǎn)（m5CTCCA motif），其甲基化位點(diǎn)優(yōu)先富集在hairpin loops結(jié)構(gòu)中心。
m5C修飾在mRNA中的分子功能
圖4：mRNA中m5C相關(guān)識(shí)別蛋白。mRNA上的m5C對(duì)翻譯調(diào)控有顯著貢獻(xiàn)。YBX1增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性，其中YBX1冷休克結(jié)構(gòu)域（CSD）中的W65是識(shí)別m5C核苷酸的關(guān)鍵殘基。ALYREF識(shí)別m5C修飾以促進(jìn)mRNA出核；K171殘基與含有m5C的寡核苷酸結(jié)合。RNA上的m5C增強(qiáng)YBX2的液-液相分離，其中W100是識(shí)別m5C的關(guān)鍵殘基。SRSF2結(jié)合m5C標(biāo)記并通過(guò)其“reader”功能調(diào)節(jié)NSUN2介導(dǎo)m5C的可變剪切效應(yīng)。P95H突變降低SRSF2對(duì)RNA m5C的結(jié)合親和力。
m5C修飾的生物學(xué)功能和病理功能
B. ALYREF介導(dǎo)出核。
C. m5C可能通過(guò)某種未知的中間介質(zhì)調(diào)控翻譯效率和核糖體占有率。
D. SRSF2優(yōu)先結(jié)合m5C-mRNA。NSUN2缺失會(huì)降低mRNA的m5C水平，并改變SRSF2的RNA結(jié)合和剪切。
E. RNA上的m5C調(diào)節(jié)依賴(lài)于YBX2的液-液相分離。
研究挑戰(zhàn)和未來(lái)展望
技術(shù)挑戰(zhàn)：
m5C修飾的檢測(cè)技術(shù)仍面臨一些挑戰(zhàn)，如亞硫酸鹽測(cè)序的不完全轉(zhuǎn)化和RNA降解問(wèn)題。需要開(kāi)發(fā)更精確、更靈敏的檢測(cè)技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)m5C修飾的全面和準(zhǔn)確檢測(cè)。
臨床應(yīng)用：
目前關(guān)于m5C修飾在疾病診斷、預(yù)后分析和治療效果評(píng)估中的研究還處于初級(jí)階段。需要進(jìn)一步探索m5C修飾在疾病中的應(yīng)用價(jià)值，開(kāi)發(fā)相關(guān)的診斷和治療方法。
未來(lái)展望：
隨著新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，如超快速亞硫酸鹽測(cè)序、m5C-TAC-seq等，m5C修飾的研究將不斷深入。此外，對(duì)m5C修飾的分子功能、發(fā)育動(dòng)態(tài)、進(jìn)化意義等方面的研究也將進(jìn)一步揭示其在生物體中的重要作用。
易小結(jié)：
本文全面總結(jié)了mRNA上m5C修飾的最新研究進(jìn)展，包括其鑒定方法、分布特征、分子功能以及在生理和病理過(guò)程中的作用。文章強(qiáng)調(diào)了m5C修飾在多種生物學(xué)過(guò)程中的重要性，并指出了當(dāng)前研究中存在的挑戰(zhàn)和未來(lái)的研究方向。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和研究的深入，m5C修飾有望成為疾病診斷和治療的新靶點(diǎn)。
RNA-BS-seq（RNA亞硫酸鹽測(cè)序）在m5C修飾檢測(cè)中發(fā)揮著重要作用
A. 確認(rèn)m5C修飾的存在
在RNA-BS-seq技術(shù)出現(xiàn)之前，由于檢測(cè)方法的限制，研究人員無(wú)法精確驗(yàn)證mRNA中是否存在m5C修飾。早期的研究主要集中在tRNA和rRNA中的m5C修飾，而對(duì)mRNA中的m5C修飾知之甚少。而RNA-BS-seq通過(guò)亞硫酸鹽處理將未修飾的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（m5C）則保持不變。這種技術(shù)首次在轉(zhuǎn)錄組水平上確認(rèn)了m5C修飾的存在，并且能夠以單堿基分辨率進(jìn)行檢測(cè)。
B. 繪制m5C修飾的全轉(zhuǎn)錄組圖譜
RNA-BS-seq結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，能夠?qū)?xì)胞中的RNA進(jìn)行整體分析，從而繪制出m5C修飾的全轉(zhuǎn)錄組圖譜。這使得研究人員能夠系統(tǒng)地了解m5C修飾在不同RNA種類(lèi)（如mRNA、tRNA、rRNA等）中的分布情況。且該技術(shù)被應(yīng)用于多種生物和組織條件，例如人類(lèi)HeLa細(xì)胞和多種小鼠組織，通過(guò)這些研究，發(fā)現(xiàn)了m5C修飾在不同物種和組織中的保守性、組織特異性和動(dòng)態(tài)性特征。
C. 揭示m5C修飾的分布特征
RNA-BS-seq技術(shù)揭示了m5C修飾在mRNA中的分布特征。例如，m5C修飾主要集中在編碼序列（CDS）區(qū)域，尤其是在mRNA翻譯起始位點(diǎn)附近的區(qū)域。此外，m5C修飾在非翻譯區(qū)（UTR）中也有分布，尤其是在5'UTR和3'UTR區(qū)域。盡管RNA-BS-seq技術(shù)提供了高分辨率的m5C修飾圖譜，但不同研究之間仍存在差異。例如，不同研究中鑒定出的m5C位點(diǎn)數(shù)量和分布模式可能不同，這表明m5C修飾的分布可能受到多種因素的影響，如物種、細(xì)胞類(lèi)型、發(fā)育階段和RNA結(jié)構(gòu)等。
D. 推動(dòng)m5C修飾功能研究
RNA-BS-seq技術(shù)為研究m5C修飾的分子功能提供了基礎(chǔ)。通過(guò)鑒定m5C修飾位點(diǎn)，研究人員能夠進(jìn)一步研究這些位點(diǎn)對(duì)mRNA穩(wěn)定性、出核、翻譯效率等生物學(xué)過(guò)程的影響。同時(shí)，RNA-BS-seq技術(shù)還為研究m5C修飾在疾病中的作用提供了重要工具。例如，在癌癥、神經(jīng)發(fā)育障礙和病毒感染等疾病中，m5C修飾的異�？赡芘c疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。通過(guò)RNA-BS-seq技術(shù)，研究人員能夠鑒定與疾病相關(guān)的m5C修飾位點(diǎn)，從而為疾病的診斷和治療提供潛在的靶點(diǎn)。
E. 技術(shù)改進(jìn)和優(yōu)化
為了克服傳統(tǒng)BS-seq技術(shù)的局限性，如反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、RNA降解等，研究人員開(kāi)發(fā)了超快速BS-seq技術(shù)。UBS-seq通過(guò)使用高濃度亞硫酸鹽和高溫反應(yīng)條件，縮短了反應(yīng)時(shí)間，減少了RNA降解，并提高了C到U的轉(zhuǎn)化效率。
總之，RNA-BS-seq技術(shù)在本文中發(fā)揮了重要作用，不僅確認(rèn)了m5C修飾的存在，還繪制了m5C修飾的全轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示了其分布特征，并推動(dòng)了m5C修飾在分子功能和疾病相關(guān)研究中的應(yīng)用。隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)和優(yōu)化，RNA-BS-seq技術(shù)將繼續(xù)為m5C修飾的研究提供強(qiáng)有力的支持。
參考文獻(xiàn)：
Wang R, Ding L, Lin Y, Luo W, Xu Z, Li W, Lu Y, Zhu Z, Lu Z, Li F, Mao X, Xia L, Li G. The Quiet Giant: Identification, Effectors, Molecular Mechanism, Physiological and Pathological Function in mRNA 5-methylcytosine Modification. Int J Biol Sci 2024; 20(15):6241-6254. doi:10.7150/ijbs.101337. https://www.ijbs.com/v20p6241.htm
m5C修飾的鑒定和分布
m5C修飾已在多種RNA種類(lèi)中被鑒定，包括核糖體RNA（rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）、信使RNA（mRNA）、增強(qiáng)子RNA（eRNA），并且最近還在長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）、環(huán)狀RNA（circRNA）和微小RNA（miRNA）中檢測(cè)到m5C修飾。m5C修飾的研究最初集中在tRNA和rRNA上，而對(duì)mRNA的研究則相對(duì)滯后。然而近年來(lái)，用于檢測(cè)m5C修飾的高通量技術(shù)發(fā)展迅速，例如亞硫酸鹽測(cè)序（BS-seq）、5-氮雜胞苷交聯(lián)測(cè)序（Aza-IP）或單核苷酸分辨率交聯(lián)免疫沉淀測(cè)序（miCLIP-seq）。特別是超快速亞硫酸氫鹽測(cè)序（UBS-seq）和m5C-TAC-seq等新技術(shù)的出現(xiàn)，進(jìn)一步提高了檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性。由于上述高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)在可以確定細(xì)胞RNA中m5C的整體分布情況。與DNA不同，mRNA m5C修飾相對(duì)較少，且由于其低豐度和高背景噪聲，對(duì)轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的m5C圖譜進(jìn)行繪制在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性。
圖1：mRNA中m5C的動(dòng)態(tài)調(diào)控過(guò)程及RNA亞硫酸鹽測(cè)序分析流程。
A. m5C及其相關(guān)調(diào)控因子的動(dòng)態(tài)過(guò)程。NSUN1、NSUN2、NSUN5和NSUN6作為mRNA上m5C甲基化的催化酶，而TET家族中的去甲基化酶則負(fù)責(zé)m5C去甲基化。B. 不同的RNA亞硫酸鹽測(cè)序分析流程用于鑒定mRNA中的m5C位點(diǎn)。Cs：未甲基化的胞嘧啶。
通過(guò)利用RNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化與基于SOLiD技術(shù)的全轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序相結(jié)合，首次以單堿基分辨率獲得了轉(zhuǎn)錄組中胞嘧啶修飾的高分辨率視圖。采用預(yù)定義的選擇標(biāo)準(zhǔn)，在mRNA序列中鑒定出8495個(gè)新的候選m5C位點(diǎn)，顯示出m5C在mRNA非翻譯區(qū)（UTR）和近Argonaute蛋白結(jié)合區(qū)域富集。
隨后，BS-seq轉(zhuǎn)向利用Illumina技術(shù)，并已在多種生物和條件下應(yīng)用，不同研究采用不同的選擇標(biāo)準(zhǔn)來(lái)篩選潛在的m5C候選位點(diǎn)。其中一項(xiàng)研究利用BS-seq在人類(lèi)HeLa細(xì)胞和多種小鼠組織中繪制了轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的m5C圖譜，鑒定出1955個(gè)mRNA上的5065個(gè)m5C位點(diǎn)，揭示了mRNA m5C位點(diǎn)的中位甲基化水平約為20.5%，與mRNA假尿苷化程度相似。在這些位點(diǎn)的分布特征方面，m5C修飾主要位于編碼序列（CDS）中，主要在CG環(huán)境中，以及mRNA翻譯起始位點(diǎn)的下游區(qū)域。在小鼠組織樣本的m5C測(cè)序中，觀察到它們顯示出與小鼠和人類(lèi)HeLa細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的中位甲基化水平和m5C分布模式相似的結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)表明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞mRNA中，m5C的分布模式具有高度的保守性。進(jìn)一步的研究揭示了不同小鼠組織和睪丸發(fā)育過(guò)程中m5C修飾的分布，表明了哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組中m5C修飾的保守性、組織特異性和動(dòng)態(tài)特征。
另一項(xiàng)研究關(guān)注了小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）和大腦中總和核poly(A) RNA的表觀轉(zhuǎn)錄組中胞嘧啶甲基化的全面圖譜，觀察到m5C位點(diǎn)在翻譯起始密碼子附近（如5'UTR末端和CDS起始處）有顯著積累，在編碼序列中耗竭，并在3'UTR中有混合的富集模式。通過(guò)比較ESCs和大腦組織中的甲基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)ESCs中有57%的甲基化位點(diǎn)在大腦組織中未甲基化。此外，這些差異甲基化通常不由差異表達(dá)引起，表明mRNA中的胞嘧啶甲基化可能以高度細(xì)胞和組織特異性的方式發(fā)生，與轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平無(wú)關(guān)。
然而，不同研究中估計(jì)的mRNA m5C位點(diǎn)數(shù)量差異很大，觀察結(jié)果不一致，難以定義一組通用的mRNA底物或常見(jiàn)的甲基化目標(biāo)序列。隨后，mRNA中m5C的研究轉(zhuǎn)向了更嚴(yán)格的位點(diǎn)鑒定。Rui Zhang等人開(kāi)發(fā)了一種計(jì)算流程，以準(zhǔn)確識(shí)別mRNA m5C位點(diǎn)，涵蓋了與轉(zhuǎn)化效率、覆蓋率和截止標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)。隨后，多個(gè)研究采用了這一工作流程。
圖2：m5C的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法示意圖。
B. 5-氮雜胞苷（5-aza-C）是一種胞嘧啶類(lèi)似物，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，RNA聚合酶會(huì)隨機(jī)將其摻入到初生（nascent ）RNA轉(zhuǎn)錄本的胞嘧啶位點(diǎn)。在m5C-RCMT催化結(jié)構(gòu)域中，半胱氨酸殘基的硫原子與目標(biāo)RNA堿基的C6位置形成共價(jià)鍵。隨后，通過(guò)甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的作用，目標(biāo)胞嘧啶的C5位置發(fā)生甲基化。在C5甲基化后，通過(guò)后續(xù)的β-消除反應(yīng)斷裂共價(jià)鍵，從而恢復(fù)自由酶。由于5-氮雜胞苷中C5位置的碳原子被氮原子（N）取代，共價(jià)鍵得以穩(wěn)定，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性酶的耗竭，從而使RNA和DNA的甲基化水平降低。
C. 在甲基化過(guò)程中，保守的半胱氨酸殘基Cys1暫時(shí)與甲基化胞嘧啶形成共價(jià)鍵，而第二個(gè)半胱氨酸Cys2對(duì)于這種催化中間體的分解至關(guān)重要。在miCLIP中，Cys2突變?yōu)楸彼幔ˋla），便于捕獲催化中間體，并允許甲基轉(zhuǎn)移酶與內(nèi)源性RNA靶標(biāo)發(fā)生交聯(lián)，而無(wú)需光交聯(lián)。最終，這些交聯(lián)的表位標(biāo)記的酶-底物復(fù)合體得以形成。
D. 從機(jī)制上講，BS-seq中存在兩條競(jìng)爭(zhēng)性途徑：一條實(shí)現(xiàn)從C到U的期望轉(zhuǎn)化，另一條則導(dǎo)致不期望的DNA/RNA降解。超快速BS測(cè)序方法（UBS-seq）使用高濃度亞硫酸鹽（約10M）和98°C的高反應(yīng)溫度，通過(guò)縮短反應(yīng)時(shí)間來(lái)減少RNA降解，并提高反應(yīng)溫度以實(shí)現(xiàn)完全的C到U轉(zhuǎn)化。
E. 在m5C-TAC-seq中，m5C被氧化為f5C，隨后用1,3-茚二酮（AI）的疊氮衍生物進(jìn)行標(biāo)記。這一過(guò)程通過(guò)生物素拉下來(lái)富集含有m5C的RNA，并在m5C位點(diǎn)誘導(dǎo)C到T的轉(zhuǎn)化。
總之研究表明，m5C修飾在mRNA中的分布具有一定的規(guī)律性。它主要集中在編碼序列（CDS）區(qū)域，尤其是在mRNA翻譯起始位點(diǎn)附近的區(qū)域。此外，m5C修飾在不同組織和細(xì)胞類(lèi)型中表現(xiàn)出保守性、組織特異性和動(dòng)態(tài)性。例如，在小鼠和人類(lèi)細(xì)胞中，m5C修飾的分布模式高度保守。
m5C修飾的效應(yīng)分子
m5C修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，涉及三種主要的調(diào)控效應(yīng)分子：甲基轉(zhuǎn)移酶（“writers”）、去甲基化酶（“erasers”）和結(jié)合蛋白（“readers”）。
- 甲基轉(zhuǎn)移酶：m5C修飾主要由NOL1/NOP2/SUN結(jié)構(gòu)域（NSUN）家族蛋白（NSUN1-7）和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）家族成員催化。其中，NSUN2和NSUN6是mRNA m5C修飾的主要甲基轉(zhuǎn)移酶。
- 去甲基化酶：關(guān)于mRNA上m5C修飾的去甲基化酶研究較少，但有研究表明TET家族蛋白可能參與m5C的擦除。
- 結(jié)合蛋白：目前已知的mRNA m5C修飾的結(jié)合蛋白包括Aly/REF出口因子（ALYREF）和Y盒結(jié)合蛋白1（YBX1）。這些蛋白能夠識(shí)別并結(jié)合m5C修飾的mRNA，從而影響mRNA的穩(wěn)定性和核質(zhì)運(yùn)輸。
圖3：mRNA中m5C修飾的分布格局及NSUN2和NSUN6對(duì)m5C位點(diǎn)的偏好。
A. 來(lái)自不同研究的Metagene圖顯示了m5C位點(diǎn)的分布情況。B. NSUN2和NSUN6在tRNA和mRNA上偏好的修飾位點(diǎn)示意圖。NSUN2靶向甲基化人類(lèi)中絕大多數(shù)tRNA的特定位點(diǎn)（C48、C49和C50）。NSUN6特異性地靶向帶有UCCA尾的tRNAThr和tRNACys的3'端C72位點(diǎn)。NSUN2依賴(lài)的位點(diǎn)傾向于包含m5CNGG motif，并且位于5'端。NSUN6主要催化II型m5C位點(diǎn)（m5CTCCA motif），其甲基化位點(diǎn)優(yōu)先富集在hairpin loops結(jié)構(gòu)中心。
m5C修飾在mRNA中的分子功能
- 穩(wěn)定性：m5C修飾能夠影響mRNA的穩(wěn)定性。例如，NSUN2通過(guò)m5C修飾增強(qiáng)SLC7A11 mRNA的穩(wěn)定性，從而賦予子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡的抗性。此外，YBX1和ALYREF等蛋白通過(guò)識(shí)別m5C修飾的mRNA，進(jìn)一步增強(qiáng)了mRNA的穩(wěn)定性。
- 出核：ALYREF能夠識(shí)別m5C修飾的mRNA，并促進(jìn)其從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。例如，ALYREF通過(guò)識(shí)別NSUN5介導(dǎo)的ACC1 mRNA上的m5C修飾，促進(jìn)其出核。
- 翻譯：m5C修飾對(duì)翻譯的影響較為復(fù)雜。一方面，m5C修飾可能通過(guò)影響mRNA的核質(zhì)分布來(lái)間接影響翻譯效率；另一方面，m5C修飾可能直接調(diào)節(jié)翻譯過(guò)程。例如，NSUN6介導(dǎo)的m5C修飾可能參與翻譯終止的質(zhì)控。
- 其他：除了上述兩種經(jīng)典的m5C識(shí)別蛋白外，通過(guò)多項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)了新的m5C結(jié)合蛋白。如SRSF2、YBX1、YBX2。
m5C修飾的生物學(xué)功能和病理功能
- 胚胎發(fā)育：m5C修飾在胚胎發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。例如，在斑馬魚(yú)中，m5C修飾能夠保護(hù)母源mRNA的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)母源-合子轉(zhuǎn)換（MZT）。
- 代謝和炎癥：m5C修飾與代謝和炎癥過(guò)程密切相關(guān)。例如，NSUN2能夠通過(guò)m5C修飾激活抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制心肌損傷。
- 免疫：m5C修飾與免疫響應(yīng)密切相關(guān)。例如，NSUN2與RoRγt耦合，通過(guò)m5C修飾調(diào)節(jié)特定細(xì)胞因子mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而影響Th17細(xì)胞的命運(yùn)。
- 病毒感染：m5C修飾在病毒感染中也發(fā)揮重要作用。例如，在SARS-CoV-2感染過(guò)程中，NSUN2的表達(dá)水平下降，從而增強(qiáng)抗病毒反應(yīng)。
- 遺傳病：m5C修飾與多種遺傳病發(fā)生發(fā)展有關(guān)。例如，NSUN2和NSUN6的突變與智力障礙等遺傳病有關(guān)。
- 癌癥：許多調(diào)控m5C修飾的mRNA m5C效應(yīng)分子已被確定參與癌癥發(fā)生發(fā)展。具體來(lái)說(shuō)，m5C修飾通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性、剪切、表達(dá)和翻譯，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。m5C在多種癌癥（如膀胱癌、食管癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤等）中調(diào)控細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、腫瘤形成、分化、耐藥性、鐵死亡和微環(huán)境。
圖5：不同研究中mRNA上m5C甲基化的多樣化生物學(xué)功能。
A. m5C促進(jìn)mRNA穩(wěn)定性。B. ALYREF介導(dǎo)出核。
C. m5C可能通過(guò)某種未知的中間介質(zhì)調(diào)控翻譯效率和核糖體占有率。
D. SRSF2優(yōu)先結(jié)合m5C-mRNA。NSUN2缺失會(huì)降低mRNA的m5C水平，并改變SRSF2的RNA結(jié)合和剪切。
E. RNA上的m5C調(diào)節(jié)依賴(lài)于YBX2的液-液相分離。
研究挑戰(zhàn)和未來(lái)展望
技術(shù)挑戰(zhàn)：
m5C修飾的檢測(cè)技術(shù)仍面臨一些挑戰(zhàn)，如亞硫酸鹽測(cè)序的不完全轉(zhuǎn)化和RNA降解問(wèn)題。需要開(kāi)發(fā)更精確、更靈敏的檢測(cè)技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)m5C修飾的全面和準(zhǔn)確檢測(cè)。
臨床應(yīng)用：
目前關(guān)于m5C修飾在疾病診斷、預(yù)后分析和治療效果評(píng)估中的研究還處于初級(jí)階段。需要進(jìn)一步探索m5C修飾在疾病中的應(yīng)用價(jià)值，開(kāi)發(fā)相關(guān)的診斷和治療方法。
未來(lái)展望：
隨著新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，如超快速亞硫酸鹽測(cè)序、m5C-TAC-seq等，m5C修飾的研究將不斷深入。此外，對(duì)m5C修飾的分子功能、發(fā)育動(dòng)態(tài)、進(jìn)化意義等方面的研究也將進(jìn)一步揭示其在生物體中的重要作用。
易小結(jié)：
本文全面總結(jié)了mRNA上m5C修飾的最新研究進(jìn)展，包括其鑒定方法、分布特征、分子功能以及在生理和病理過(guò)程中的作用。文章強(qiáng)調(diào)了m5C修飾在多種生物學(xué)過(guò)程中的重要性，并指出了當(dāng)前研究中存在的挑戰(zhàn)和未來(lái)的研究方向。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和研究的深入，m5C修飾有望成為疾病診斷和治療的新靶點(diǎn)。
RNA-BS-seq（RNA亞硫酸鹽測(cè)序）在m5C修飾檢測(cè)中發(fā)揮著重要作用
A. 確認(rèn)m5C修飾的存在
在RNA-BS-seq技術(shù)出現(xiàn)之前，由于檢測(cè)方法的限制，研究人員無(wú)法精確驗(yàn)證mRNA中是否存在m5C修飾。早期的研究主要集中在tRNA和rRNA中的m5C修飾，而對(duì)mRNA中的m5C修飾知之甚少。而RNA-BS-seq通過(guò)亞硫酸鹽處理將未修飾的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（m5C）則保持不變。這種技術(shù)首次在轉(zhuǎn)錄組水平上確認(rèn)了m5C修飾的存在，并且能夠以單堿基分辨率進(jìn)行檢測(cè)。
B. 繪制m5C修飾的全轉(zhuǎn)錄組圖譜
RNA-BS-seq結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，能夠?qū)?xì)胞中的RNA進(jìn)行整體分析，從而繪制出m5C修飾的全轉(zhuǎn)錄組圖譜。這使得研究人員能夠系統(tǒng)地了解m5C修飾在不同RNA種類(lèi)（如mRNA、tRNA、rRNA等）中的分布情況。且該技術(shù)被應(yīng)用于多種生物和組織條件，例如人類(lèi)HeLa細(xì)胞和多種小鼠組織，通過(guò)這些研究，發(fā)現(xiàn)了m5C修飾在不同物種和組織中的保守性、組織特異性和動(dòng)態(tài)性特征。
C. 揭示m5C修飾的分布特征
RNA-BS-seq技術(shù)揭示了m5C修飾在mRNA中的分布特征。例如，m5C修飾主要集中在編碼序列（CDS）區(qū)域，尤其是在mRNA翻譯起始位點(diǎn)附近的區(qū)域。此外，m5C修飾在非翻譯區(qū)（UTR）中也有分布，尤其是在5'UTR和3'UTR區(qū)域。盡管RNA-BS-seq技術(shù)提供了高分辨率的m5C修飾圖譜，但不同研究之間仍存在差異。例如，不同研究中鑒定出的m5C位點(diǎn)數(shù)量和分布模式可能不同，這表明m5C修飾的分布可能受到多種因素的影響，如物種、細(xì)胞類(lèi)型、發(fā)育階段和RNA結(jié)構(gòu)等。
D. 推動(dòng)m5C修飾功能研究
RNA-BS-seq技術(shù)為研究m5C修飾的分子功能提供了基礎(chǔ)。通過(guò)鑒定m5C修飾位點(diǎn)，研究人員能夠進(jìn)一步研究這些位點(diǎn)對(duì)mRNA穩(wěn)定性、出核、翻譯效率等生物學(xué)過(guò)程的影響。同時(shí)，RNA-BS-seq技術(shù)還為研究m5C修飾在疾病中的作用提供了重要工具。例如，在癌癥、神經(jīng)發(fā)育障礙和病毒感染等疾病中，m5C修飾的異�？赡芘c疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。通過(guò)RNA-BS-seq技術(shù)，研究人員能夠鑒定與疾病相關(guān)的m5C修飾位點(diǎn)，從而為疾病的診斷和治療提供潛在的靶點(diǎn)。
E. 技術(shù)改進(jìn)和優(yōu)化
為了克服傳統(tǒng)BS-seq技術(shù)的局限性，如反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、RNA降解等，研究人員開(kāi)發(fā)了超快速BS-seq技術(shù)。UBS-seq通過(guò)使用高濃度亞硫酸鹽和高溫反應(yīng)條件，縮短了反應(yīng)時(shí)間，減少了RNA降解，并提高了C到U的轉(zhuǎn)化效率。
總之，RNA-BS-seq技術(shù)在本文中發(fā)揮了重要作用，不僅確認(rèn)了m5C修飾的存在，還繪制了m5C修飾的全轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示了其分布特征，并推動(dòng)了m5C修飾在分子功能和疾病相關(guān)研究中的應(yīng)用。隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)和優(yōu)化，RNA-BS-seq技術(shù)將繼續(xù)為m5C修飾的研究提供強(qiáng)有力的支持。
參考文獻(xiàn)：
Wang R, Ding L, Lin Y, Luo W, Xu Z, Li W, Lu Y, Zhu Z, Lu Z, Li F, Mao X, Xia L, Li G. The Quiet Giant: Identification, Effectors, Molecular Mechanism, Physiological and Pathological Function in mRNA 5-methylcytosine Modification. Int J Biol Sci 2024; 20(15):6241-6254. doi:10.7150/ijbs.101337. https://www.ijbs.com/v20p6241.htm
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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- 合成生物學(xué)之底盤(pán)細(xì)胞改造對(duì)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的促進(jìn)作用及優(yōu)勢(shì)
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