文獻(xiàn)解讀：利用WGBS揭示跨代遺傳的DNA甲基化機(jī)制
近年來(lái)，全球代謝性疾�。ㄓ绕涫�2型糖尿病和肥胖癥）的發(fā)病率顯著上升，且發(fā)病年齡趨于年輕化。研究表明，孕期不良環(huán)境暴露（如激素失衡、營(yíng)養(yǎng)不良等）可能通過(guò)“發(fā)育起源健康與疾病”（DOHaD）理論影響后代的長(zhǎng)期代謝健康。母體雄激素水平異常與多種代謝紊亂相關(guān)，如多囊卵巢綜合征（PCOS）等。然而母體雄激素暴露對(duì)雄性后代的跨代代謝影響尚不清楚。
近日，山東大學(xué)婦兒與生殖健康研究院、生殖醫(yī)學(xué)與子代健康全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院陳子江院士、趙涵教授、張玉青副研究員團(tuán)隊(duì)合作，通過(guò)大規(guī)模母嬰隊(duì)列研究和多代小鼠模型，研究了母體雄激素暴露（Androgen exposure，AE）對(duì)雄性后代糖尿病易感性的跨代遺傳機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，母體高雄激素水平會(huì)使雄性后代在多個(gè)世代中出現(xiàn)血糖調(diào)節(jié)異常，這種易感性主要通過(guò)DNA甲基化變化在精子中傳遞，影響胰島β細(xì)胞功能基因表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素分泌受損。相關(guān)研究成果以《Transgenerational inheritance of diabetes susceptibility in male offspring with maternal androgen exposure》為題發(fā)表于Cell子刊《Cell Discovery》。
標(biāo)題：Transgenerational inheritance of diabetes susceptibility in male offspring with maternal androgen exposure（母系雄激素暴露的雄性后代糖尿病易感性的跨代遺傳）
時(shí)間：2025-02-12
期刊：Cell Discovery
影響因子：IF13/Q1
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、RNA-seq、MeDIP-qPCR等（易基因金牌技術(shù)）
本研究通過(guò)大規(guī)模母嬰隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)母體高雄激素水平會(huì)使雄性子代易患β細(xì)胞功能障礙。在三個(gè)世代中，產(chǎn)前AE的雄性后代小鼠表現(xiàn)出高血糖和葡萄糖耐受不良，且隨著年齡增長(zhǎng)和高脂飲食的影響，這些癥狀進(jìn)一步加劇。從機(jī)制上講，胰島素分泌受損是這種跨代糖尿病易感性的根本原因。通過(guò)對(duì)甲基化組（WGBS）和轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）的綜合分析結(jié)果表明AE-F1代精子中β細(xì)胞功能基因存在差異性DNA甲基化，這種甲基化差異被傳遞到AE-F2代胰島，并進(jìn)一步保留在AE-F2代精子中，導(dǎo)致與胰島素分泌相關(guān)基因（包括Pdx1、Irs1、Ptprn2和Cacna1c）表達(dá)降低。研究在糖尿病患者以及母體高雄激素水平的雄性子代血液中驗(yàn)證了AE-F1代精子中的甲基化特征。此外，限制飲食和二甲雙胍治療通過(guò)恢復(fù)異常的精子DNA甲基化，不僅使AE-F1代雄性的高血糖正�；�，還可阻斷其向后代的傳遞。本研究結(jié)果闡明了母體AE通過(guò)DNA甲基化變化導(dǎo)致雄性后代葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損的跨代遺傳，為保護(hù)后代代謝健康提供甲基化生物標(biāo)志物和治療策略。
研究方法
母嬰隊(duì)列研究：研究納入了561名母體雄激素水平異常的女性所生的男孩和1122名對(duì)照組男孩，評(píng)估了他們的代謝參數(shù)。
小鼠模型：通過(guò)向懷孕雌鼠注射二氫睪酮（DHT）建立雄激素暴露模型，觀察F1-F4代雄性后代的代謝表型。
代謝測(cè)試：包括血糖水平、胰島素釋放測(cè)試、胰島素耐受性測(cè)試等。
DNA甲基化分析：使用全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）分析F1代精子的DNA甲基化模式，并結(jié)合RNA測(cè)序（RNA-seq）分析F2代胰島的轉(zhuǎn)錄組變化。
干預(yù)實(shí)驗(yàn)：對(duì)F1代雄性小鼠進(jìn)行節(jié)食（CR）和二甲雙胍（Met）干預(yù)，評(píng)估其對(duì)代謝異常的改善效果及其對(duì)后代的影響。
結(jié)果圖形
（1）母體雄激素暴露導(dǎo)致雄性后代在早期生命階段出現(xiàn)代際和跨代的葡萄糖代謝紊亂
b-c. 母體雄激素水平正常和異常的女性所生男孩的HOMA-β（b）和BMI（c）水平。
d. 小鼠實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和來(lái)自對(duì)照組（Ctrl）及雄激素暴露（AE）組的后代繁殖示意圖。
e. F1-F4代雄性后代在8周齡時(shí)的進(jìn)食后血糖水平。對(duì)照組（F1：n=8；F2：n=14；F3：n=7；F4：n=9）；雄激素暴露組（F1：n=13；F2：n=12；F3：n=8；F4：n=13）。
f. F1-F4代雄性后代在8周齡時(shí)的腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）及相應(yīng)的血糖曲線下面積（AUC）。對(duì)照組（F1：n=8；F2：n=5；F3：n=11；F4：n=8）；雄激素暴露組（F1：n=9；F2：n=5；F3：n=10；F4：n=8）。
（2）隨著年齡增長(zhǎng)和肥胖發(fā)生，F(xiàn)1-F3代雄性小鼠的高血糖和葡萄糖耐受不良進(jìn)一步加劇
圖2：產(chǎn)前雄激素暴露（AE）導(dǎo)致F1-F3代雄性后代的跨代高血糖和葡萄糖耐受不良，且這些癥狀隨著年齡增長(zhǎng)和高脂飲食而加劇。
a. 小鼠模型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。
b. F1-F4代雄性后代在不同年齡時(shí)的進(jìn)食后血糖水平。普通飲食（NCD）組：F1（8周齡，n=8；16周齡，n=11；32周齡，n=11）、F2（8周齡，n=14；16周齡，n=13；32周齡，n=15）、F3（8周齡，n=7；16周齡，n=15；32周齡，n=15）、F4（8周齡，n=9；16周齡，n=10；32周齡，n=9）；雄激素暴露（AE）組：F1（8周齡，n=13；16周齡，n=15；32周齡，n=10）、F2（8周齡，n=12；16周齡，n=12；32周齡，n=14）、F3（8周齡，n=8；16周齡，n=9；32周齡，n=10）、F4（8周齡，n=13；16周齡，n=13；32周齡，n=11）。
c. F1代雄性后代在不同年齡時(shí)的腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）及相應(yīng)的血糖曲線下面積（AUC）。普通飲食（NCD）組：8周齡，n=8；16周齡，n=9；32周齡，n=5；高脂飲食（HFD）組：16周齡，n=8；雄激素暴露（AE）組：NCD飲食8周齡，n=9；16周齡，n=11；32周齡，n=6；HFD飲食16周齡，n=8。
d. F2代雄性后代在不同年齡時(shí)的腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）及相應(yīng)的血糖曲線下面積（AUC）。普通飲食（NCD）組：8周齡，n=5；16周齡，n=5；32周齡，n=11；高脂飲食（HFD）組：16周齡，n=6；雄激素暴露（AE）組：NCD飲食8周齡，n=5；16周齡，n=5；32周齡，n=12；HFD飲食16周齡，n=6。
e. F3代雄性后代在不同年齡時(shí)的腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）及相應(yīng)的血糖曲線下面積（AUC）。普通飲食（NCD）組：8周齡，n=11；16周齡，n=7；32周齡，n=6；高脂飲食（HFD）組：16周齡，n=6；雄激素暴露（AE）組：NCD飲食8周齡，n=10；16周齡，n=7；32周齡，n=6；HFD飲食16周齡，n=10。
f. F4代雄性后代在不同年齡時(shí)的腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）及相應(yīng)的血糖曲線下面積（AUC）。普通飲食（NCD）組：8周齡，n=8；16周齡，n=9；32周齡，n=10；高脂飲食（HFD）組：16周齡，n=10；雄激素暴露（AE）組：NCD飲食8周齡，n=8；16周齡，n=12；32周齡，n=9；HFD飲食16周齡，n=9。
（3）產(chǎn)前AE跨代高血糖效應(yīng)歸因于雄性后代的胰島β細(xì)胞功能障礙
b. F1代雄性小鼠在8周齡時(shí)，腹腔注射葡萄糖后0、15和30分鐘的血清胰島素水平，以及相應(yīng)的曲線下面積（AUC）（n=6）。
c. F1代雄性小鼠在8周齡時(shí)的胰島素生成指數(shù)（n=6）。
d. 從8周齡的對(duì)照組（Ctrl）和AE-F1雄性小鼠中分離的胰島，在3.3 mM或16.7 mM葡萄糖刺激下的胰島素分泌實(shí)驗(yàn)（n=3）。
e. F1代雄性小鼠在32周齡時(shí)的HOMA-β水平（n=6）。
f. F1代雄性小鼠在32周齡時(shí)，腹腔注射葡萄糖后0、15和30分鐘的血清胰島素水平，以及相應(yīng)的曲線下面積（AUC）（n=6）。
g. F1代雄性小鼠在32周齡時(shí)的胰島素生成指數(shù)（n=6）。
h. 從32周齡的對(duì)照組（Ctrl）和AE-F1雄性小鼠中分離的胰島，在3.3 mM（Ctrl: n=5; AE: n=3）或16.7 mM（Ctrl: n=4; AE: n=5）葡萄糖刺激下的胰島素分泌實(shí)驗(yàn)。
i. F2代雄性小鼠在8周齡時(shí)的HOMA-β水平（n=6）。
j. F2代雄性小鼠在8周齡時(shí)，腹腔注射葡萄糖后0、15和30分鐘的血清胰島素水平，以及相應(yīng)的曲線下面積（AUC）（n=5）。
k. F2代雄性小鼠在8周齡時(shí)的胰島素生成指數(shù)（n=5）。
l. 從8周齡的對(duì)照組（Ctrl）和AE-F2雄性小鼠中分離的胰島，在3.3 mM（Ctrl: n=5; AE: n=4）或16.7 mM（Ctrl: n=5; AE: n=5）葡萄糖刺激下的胰島素分泌實(shí)驗(yàn)。
m. 對(duì)32周齡F1小鼠和8周齡F2小鼠的代表性胰腺切片進(jìn)行INSULIN（綠色）和DAPI（藍(lán)色）染色，并對(duì)胰島素強(qiáng)度和胰腺胰島素含量進(jìn)行定量分析（n=3-5）。
（4）產(chǎn)前AE導(dǎo)致與胰島素分泌相關(guān)的精子DNA甲基化發(fā)生變化
研究者通過(guò)全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）技術(shù)，分析了產(chǎn)前雄激素暴露（AE）對(duì)F1代雄性小鼠精子DNA甲基化的影響。比較了AE組和對(duì)照組（Ctrl）小鼠精子的DNA甲基化模式，以鑒定差異甲基化區(qū)域（DMRs）。
b. 對(duì)照組（Ctrl）和AE-F1精子的全基因組CG甲基化水平。
c. 對(duì)照組（Ctrl）和AE-F1精子的CG甲基化水平的Meta分析圖。
d. 比較對(duì)照組和AE-F1精子甲基化組的差異甲基化區(qū)域（DMRs）。
e. 通過(guò)對(duì)F1精子中DMRs基因進(jìn)行KEGG分析，得出的前10條富集的代謝通路。
f. 通過(guò)對(duì)F1精子中具有高甲基化DMRs（紅色）和低甲基化DMRs（藍(lán)色）的基因進(jìn)行KEGG分析，得出的前5條富集的代謝通路。
g. 紅色表示通過(guò)精子WGBS鑒定出在胰島素分泌通路中的DMRs基因。
h. 用于F2代胰島RNA-seq的實(shí)驗(yàn)方法示意圖。
i. 來(lái)自對(duì)照組（n=3）和AE-F2胰島（n=4）的轉(zhuǎn)錄組主成分分析（PCA）。
j. 與對(duì)照組相比，AE-F2胰島中差異上調(diào)和下調(diào)基因的數(shù)量。
k. F2代胰島轉(zhuǎn)錄組和F1代精子甲基化組共有的前10條富集的KEGG通路。
（5）從AE-F1精子持續(xù)到AE-F2胰島的DNA甲基化變化抑制β細(xì)胞功能基因表達(dá)
b. 通過(guò)對(duì)a中296個(gè)重疊基因進(jìn)行KEGG富集分析確定的前10條通路。
c. 對(duì)296個(gè)在WGBS和RNA-seq數(shù)據(jù)集中共同變化基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，分析這些基因所富集的通路。
d. 在b和c中鑒定出的胰島素分泌通路中的基因列表。它詳細(xì)列出了基因功能、AE-F1精子中胰島素分泌基因的差異甲基化水平以及AE-F2胰島中基因表達(dá)變化。
e. 通過(guò)MeDIP-qPCR分析Ctrl-F1和AE-F1精子中Pdx1、Irs1、Ptprn2和Cacna1c的DNA甲基化水平（n=3）。
f. 通過(guò)MeDIP-qPCR分析Ctrl-F2和AE-F2 E18.5胰腺中Pdx1、Irs1、Ptprn2和Cacna1c的DNA甲基化水平（n=3）。
g. 通過(guò)MeDIP-qPCR分析Ctrl-F2（n=4）和AE-F2成年胰島中Pdx1、Irs1、Ptprn2和Cacna1c的DNA甲基化水平（n=5）。
h. 通過(guò)qRT-PCR分析Ctrl-F2（n=4）和AE-F2成年胰島中Pdx1、Irs1、Ptprn2和Cacna1c的mRNA表達(dá)水平（n=5）。
i. 通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)分析Ctrl-F2和AE-F2成年小鼠胰島中PDX1、IRS1、PTPRN2和CACNA1C的蛋白水平。
j. F1至F3代精子中胰島素分泌基因的甲基化譜。水平線上的垂直條表示單個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平（0-1）。方框表示啟動(dòng)子或genebody區(qū)域中的DMR。
（6）AE-F1精子和2型糖尿�。═2D）患者的共有甲基化特征在AE母親所生男孩的血液中得到驗(yàn)證
b. F1代精子WGBS、T2D患者胰島和T2D患者血液研究（Fraszczyk等人的研究）中共同的甲基化基因Venn網(wǎng)絡(luò)圖。
c. F1代精子WGBS、T2D患者胰島和T2D患者血液研究（Cardona等人的研究）中共同的甲基化基因Venn網(wǎng)絡(luò)圖。
d. F1代精子WGBS、T2D患者胰島和T2D患者血液研究（Relloso等人的研究）中共同的甲基化基因Venn網(wǎng)絡(luò)圖。
e. MeDIP-qPCR分析了對(duì)照組兒子（n=20）和母體雄激素水平異常的男孩（n=20）血液中的DNA甲基化水平。
（7）節(jié)食（CR）和二甲雙胍（Met）改善了AE-F1雄性的代謝功能障礙，并阻斷了這些功能障礙向后代傳遞
b. 經(jīng)過(guò)相應(yīng)干預(yù)后F1代雄性小鼠在禁食6小時(shí)后的血糖水平。
c. 經(jīng)過(guò)相應(yīng)干預(yù)后F1代雄性小鼠進(jìn)食后的血糖水平。
d. 經(jīng)過(guò)相應(yīng)干預(yù)后F1代雄性小鼠的腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）及相關(guān)曲線下面積。
e. 經(jīng)過(guò)相應(yīng)干預(yù)后F1代雄性小鼠的胰島素耐受性試驗(yàn)（ITT）及相關(guān)曲線下面積。
f. 經(jīng)過(guò)干預(yù)的F1代雄性小鼠所生的F2代雄性后代在禁食6小時(shí)后的血糖水平。
g. 經(jīng)過(guò)干預(yù)的F1代雄性小鼠所生的F2代雄性后代進(jìn)食后的血糖水平。
h. 經(jīng)過(guò)干預(yù)的F1代雄性小鼠所生的F2代雄性后代的葡萄糖耐量試驗(yàn)及相關(guān)曲線下面積。
i. 經(jīng)過(guò)干預(yù)的F1代雄性小鼠所生的F2代雄性后代的胰島素耐受性試驗(yàn)及相關(guān)曲線下面積。
（8）節(jié)食和二甲雙胍恢復(fù)了雄性后代小鼠中異常的DNA甲基化和β細(xì)胞功能基因表達(dá)。
b. 來(lái)自父本對(duì)照組（Ctrl）、AE、AE-CR和AE-Met處理的F2代雄性小鼠的代表性胰腺切片，用PDX1（紅色）、INSULIN（綠色）和DAPI（藍(lán)色）進(jìn)行染色。對(duì)胰島素陽(yáng)性β細(xì)胞中的PDX1熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析（n=3）。
c. 來(lái)自父本對(duì)照組（Ctrl）、AE、AE-CR和AE-Met處理的F2代雄性小鼠的代表性胰腺切片，用IRS1（紅色）、INSULIN（綠色）和DAPI（藍(lán)色）進(jìn)行染色。對(duì)胰島素陽(yáng)性β細(xì)胞中的IRS1熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析（n=3）。
d. 來(lái)自父本對(duì)照組（Ctrl）、AE、AE-CR和AE-Met處理的F2代雄性小鼠的代表性胰腺切片，用CACNA1C（紅色）、INSULIN（綠色）和DAPI（藍(lán)色）進(jìn)行染色。對(duì)胰島素陽(yáng)性β細(xì)胞中的CACNA1C熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析（n=3）。
e. 工作模型示意圖：母體AE使所生男孩易患β細(xì)胞功能障礙和DNA甲基化變化。在小鼠中，產(chǎn)前AE通過(guò)精子誘導(dǎo)DNA甲基化重編程，導(dǎo)致后代胰島胰島素分泌缺陷，從而在F1至F3代雄性后代中隨著年齡增長(zhǎng)和高脂飲食出現(xiàn)高血糖和葡萄糖耐受不良。節(jié)食（CR）和二甲雙胍（Met）干預(yù)恢復(fù)了葡萄糖穩(wěn)態(tài)，并阻斷高血糖向后代傳遞。
易小結(jié)
本研究通過(guò)WGBS和對(duì)應(yīng)的RNA-seq等分析揭示了母體雄激素暴露會(huì)通過(guò)精子DNA甲基化變化跨代傳遞胰島素分泌功能障礙，增加雄性后代患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。節(jié)食和二甲雙胍干預(yù)可有效改善這種代謝異常，并阻斷其跨代傳遞。這些發(fā)現(xiàn)為預(yù)防和治療代謝性疾病提供了新的策略和潛在的生物標(biāo)志物。
WGBS在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用
鑒定差異甲基化區(qū)域：通過(guò)WGBS，研究者在F1代精子中鑒定出大量與胰島素分泌相關(guān)的DMRs，為理解跨代遺傳機(jī)制提供了重要線索。
揭示跨代傳遞的分子基礎(chǔ)：WGBS結(jié)果顯示，這些甲基化變化在F2代胰島中持續(xù)存在，并影響相關(guān)基因表達(dá)，從而揭示了跨代遺傳的分子基礎(chǔ)。
評(píng)估干預(yù)效果：通過(guò)比較干預(yù)前后的WGBS數(shù)據(jù)，研究者發(fā)現(xiàn)CR和Met干預(yù)能部分恢復(fù)異常的DNA甲基化模式，從而評(píng)估了干預(yù)措施的潛在機(jī)制。
參考文獻(xiàn)：
Zhang Y, Hu S, Han S, Liu C, Liang X, Li Y, Lin Z, Qin Y, Geng C, Liu Y, Cui L, Hu J, Zhang C, Wang Z, Liu X, Ma J, Chen ZJ, Zhao H. Transgenerational inheritance of diabetes susceptibility in male offspring with maternal androgen exposure. Cell Discov. 2025 Feb 12;11(1):14. pii: 10.1038/s41421-025-00769-1. doi: 10.1038/s41421-025-00769-1.
近日，山東大學(xué)婦兒與生殖健康研究院、生殖醫(yī)學(xué)與子代健康全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院陳子江院士、趙涵教授、張玉青副研究員團(tuán)隊(duì)合作，通過(guò)大規(guī)模母嬰隊(duì)列研究和多代小鼠模型，研究了母體雄激素暴露（Androgen exposure，AE）對(duì)雄性后代糖尿病易感性的跨代遺傳機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，母體高雄激素水平會(huì)使雄性后代在多個(gè)世代中出現(xiàn)血糖調(diào)節(jié)異常，這種易感性主要通過(guò)DNA甲基化變化在精子中傳遞，影響胰島β細(xì)胞功能基因表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素分泌受損。相關(guān)研究成果以《Transgenerational inheritance of diabetes susceptibility in male offspring with maternal androgen exposure》為題發(fā)表于Cell子刊《Cell Discovery》。
標(biāo)題：Transgenerational inheritance of diabetes susceptibility in male offspring with maternal androgen exposure（母系雄激素暴露的雄性后代糖尿病易感性的跨代遺傳）
時(shí)間：2025-02-12
期刊：Cell Discovery
影響因子：IF13/Q1
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、RNA-seq、MeDIP-qPCR等（易基因金牌技術(shù)）
本研究通過(guò)大規(guī)模母嬰隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)母體高雄激素水平會(huì)使雄性子代易患β細(xì)胞功能障礙。在三個(gè)世代中，產(chǎn)前AE的雄性后代小鼠表現(xiàn)出高血糖和葡萄糖耐受不良，且隨著年齡增長(zhǎng)和高脂飲食的影響，這些癥狀進(jìn)一步加劇。從機(jī)制上講，胰島素分泌受損是這種跨代糖尿病易感性的根本原因。通過(guò)對(duì)甲基化組（WGBS）和轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）的綜合分析結(jié)果表明AE-F1代精子中β細(xì)胞功能基因存在差異性DNA甲基化，這種甲基化差異被傳遞到AE-F2代胰島，并進(jìn)一步保留在AE-F2代精子中，導(dǎo)致與胰島素分泌相關(guān)基因（包括Pdx1、Irs1、Ptprn2和Cacna1c）表達(dá)降低。研究在糖尿病患者以及母體高雄激素水平的雄性子代血液中驗(yàn)證了AE-F1代精子中的甲基化特征。此外，限制飲食和二甲雙胍治療通過(guò)恢復(fù)異常的精子DNA甲基化，不僅使AE-F1代雄性的高血糖正�；�，還可阻斷其向后代的傳遞。本研究結(jié)果闡明了母體AE通過(guò)DNA甲基化變化導(dǎo)致雄性后代葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損的跨代遺傳，為保護(hù)后代代謝健康提供甲基化生物標(biāo)志物和治療策略。
研究方法
母嬰隊(duì)列研究：研究納入了561名母體雄激素水平異常的女性所生的男孩和1122名對(duì)照組男孩，評(píng)估了他們的代謝參數(shù)。
小鼠模型：通過(guò)向懷孕雌鼠注射二氫睪酮（DHT）建立雄激素暴露模型，觀察F1-F4代雄性后代的代謝表型。
代謝測(cè)試：包括血糖水平、胰島素釋放測(cè)試、胰島素耐受性測(cè)試等。
DNA甲基化分析：使用全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）分析F1代精子的DNA甲基化模式，并結(jié)合RNA測(cè)序（RNA-seq）分析F2代胰島的轉(zhuǎn)錄組變化。
干預(yù)實(shí)驗(yàn)：對(duì)F1代雄性小鼠進(jìn)行節(jié)食（CR）和二甲雙胍（Met）干預(yù)，評(píng)估其對(duì)代謝異常的改善效果及其對(duì)后代的影響。
結(jié)果圖形
（1）母體雄激素暴露導(dǎo)致雄性后代在早期生命階段出現(xiàn)代際和跨代的葡萄糖代謝紊亂
圖1：母體雄激素暴露導(dǎo)致雄性后代在早期生命階段出現(xiàn)代際和跨代的葡萄糖代謝紊亂。
a. 母體雄激素水平異常（n=561）和正常（n=1122）的女性所生男孩隊(duì)列，年齡為2-12歲。b-c. 母體雄激素水平正常和異常的女性所生男孩的HOMA-β（b）和BMI（c）水平。
d. 小鼠實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和來(lái)自對(duì)照組（Ctrl）及雄激素暴露（AE）組的后代繁殖示意圖。
e. F1-F4代雄性后代在8周齡時(shí)的進(jìn)食后血糖水平。對(duì)照組（F1：n=8；F2：n=14；F3：n=7；F4：n=9）；雄激素暴露組（F1：n=13；F2：n=12；F3：n=8；F4：n=13）。
f. F1-F4代雄性后代在8周齡時(shí)的腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）及相應(yīng)的血糖曲線下面積（AUC）。對(duì)照組（F1：n=8；F2：n=5；F3：n=11；F4：n=8）；雄激素暴露組（F1：n=9；F2：n=5；F3：n=10；F4：n=8）。
（2）隨著年齡增長(zhǎng)和肥胖發(fā)生，F(xiàn)1-F3代雄性小鼠的高血糖和葡萄糖耐受不良進(jìn)一步加劇
圖2：產(chǎn)前雄激素暴露（AE）導(dǎo)致F1-F3代雄性后代的跨代高血糖和葡萄糖耐受不良，且這些癥狀隨著年齡增長(zhǎng)和高脂飲食而加劇。
b. F1-F4代雄性后代在不同年齡時(shí)的進(jìn)食后血糖水平。普通飲食（NCD）組：F1（8周齡，n=8；16周齡，n=11；32周齡，n=11）、F2（8周齡，n=14；16周齡，n=13；32周齡，n=15）、F3（8周齡，n=7；16周齡，n=15；32周齡，n=15）、F4（8周齡，n=9；16周齡，n=10；32周齡，n=9）；雄激素暴露（AE）組：F1（8周齡，n=13；16周齡，n=15；32周齡，n=10）、F2（8周齡，n=12；16周齡，n=12；32周齡，n=14）、F3（8周齡，n=8；16周齡，n=9；32周齡，n=10）、F4（8周齡，n=13；16周齡，n=13；32周齡，n=11）。
c. F1代雄性后代在不同年齡時(shí)的腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）及相應(yīng)的血糖曲線下面積（AUC）。普通飲食（NCD）組：8周齡，n=8；16周齡，n=9；32周齡，n=5；高脂飲食（HFD）組：16周齡，n=8；雄激素暴露（AE）組：NCD飲食8周齡，n=9；16周齡，n=11；32周齡，n=6；HFD飲食16周齡，n=8。
d. F2代雄性后代在不同年齡時(shí)的腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）及相應(yīng)的血糖曲線下面積（AUC）。普通飲食（NCD）組：8周齡，n=5；16周齡，n=5；32周齡，n=11；高脂飲食（HFD）組：16周齡，n=6；雄激素暴露（AE）組：NCD飲食8周齡，n=5；16周齡，n=5；32周齡，n=12；HFD飲食16周齡，n=6。
e. F3代雄性后代在不同年齡時(shí)的腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）及相應(yīng)的血糖曲線下面積（AUC）。普通飲食（NCD）組：8周齡，n=11；16周齡，n=7；32周齡，n=6；高脂飲食（HFD）組：16周齡，n=6；雄激素暴露（AE）組：NCD飲食8周齡，n=10；16周齡，n=7；32周齡，n=6；HFD飲食16周齡，n=10。
f. F4代雄性后代在不同年齡時(shí)的腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）及相應(yīng)的血糖曲線下面積（AUC）。普通飲食（NCD）組：8周齡，n=8；16周齡，n=9；32周齡，n=10；高脂飲食（HFD）組：16周齡，n=10；雄激素暴露（AE）組：NCD飲食8周齡，n=8；16周齡，n=12；32周齡，n=9；HFD飲食16周齡，n=9。
（3）產(chǎn)前AE跨代高血糖效應(yīng)歸因于雄性后代的胰島β細(xì)胞功能障礙
圖3：產(chǎn)前AE導(dǎo)致雄性后代胰島素分泌的跨代缺陷。
a. F1代雄性小鼠在8周齡時(shí)的HOMA-β水平（n=6）。b. F1代雄性小鼠在8周齡時(shí)，腹腔注射葡萄糖后0、15和30分鐘的血清胰島素水平，以及相應(yīng)的曲線下面積（AUC）（n=6）。
c. F1代雄性小鼠在8周齡時(shí)的胰島素生成指數(shù)（n=6）。
d. 從8周齡的對(duì)照組（Ctrl）和AE-F1雄性小鼠中分離的胰島，在3.3 mM或16.7 mM葡萄糖刺激下的胰島素分泌實(shí)驗(yàn)（n=3）。
e. F1代雄性小鼠在32周齡時(shí)的HOMA-β水平（n=6）。
f. F1代雄性小鼠在32周齡時(shí)，腹腔注射葡萄糖后0、15和30分鐘的血清胰島素水平，以及相應(yīng)的曲線下面積（AUC）（n=6）。
g. F1代雄性小鼠在32周齡時(shí)的胰島素生成指數(shù)（n=6）。
h. 從32周齡的對(duì)照組（Ctrl）和AE-F1雄性小鼠中分離的胰島，在3.3 mM（Ctrl: n=5; AE: n=3）或16.7 mM（Ctrl: n=4; AE: n=5）葡萄糖刺激下的胰島素分泌實(shí)驗(yàn)。
i. F2代雄性小鼠在8周齡時(shí)的HOMA-β水平（n=6）。
j. F2代雄性小鼠在8周齡時(shí)，腹腔注射葡萄糖后0、15和30分鐘的血清胰島素水平，以及相應(yīng)的曲線下面積（AUC）（n=5）。
k. F2代雄性小鼠在8周齡時(shí)的胰島素生成指數(shù)（n=5）。
l. 從8周齡的對(duì)照組（Ctrl）和AE-F2雄性小鼠中分離的胰島，在3.3 mM（Ctrl: n=5; AE: n=4）或16.7 mM（Ctrl: n=5; AE: n=5）葡萄糖刺激下的胰島素分泌實(shí)驗(yàn)。
m. 對(duì)32周齡F1小鼠和8周齡F2小鼠的代表性胰腺切片進(jìn)行INSULIN（綠色）和DAPI（藍(lán)色）染色，并對(duì)胰島素強(qiáng)度和胰腺胰島素含量進(jìn)行定量分析（n=3-5）。
（4）產(chǎn)前AE導(dǎo)致與胰島素分泌相關(guān)的精子DNA甲基化發(fā)生變化
研究者通過(guò)全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）技術(shù)，分析了產(chǎn)前雄激素暴露（AE）對(duì)F1代雄性小鼠精子DNA甲基化的影響。比較了AE組和對(duì)照組（Ctrl）小鼠精子的DNA甲基化模式，以鑒定差異甲基化區(qū)域（DMRs）。
圖4：F1代精子中的DNA甲基化特征以及F2代胰島的轉(zhuǎn)錄組變化
a. F1代雄性小鼠精子全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）示意圖。b. 對(duì)照組（Ctrl）和AE-F1精子的全基因組CG甲基化水平。
c. 對(duì)照組（Ctrl）和AE-F1精子的CG甲基化水平的Meta分析圖。
d. 比較對(duì)照組和AE-F1精子甲基化組的差異甲基化區(qū)域（DMRs）。
e. 通過(guò)對(duì)F1精子中DMRs基因進(jìn)行KEGG分析，得出的前10條富集的代謝通路。
f. 通過(guò)對(duì)F1精子中具有高甲基化DMRs（紅色）和低甲基化DMRs（藍(lán)色）的基因進(jìn)行KEGG分析，得出的前5條富集的代謝通路。
g. 紅色表示通過(guò)精子WGBS鑒定出在胰島素分泌通路中的DMRs基因。
h. 用于F2代胰島RNA-seq的實(shí)驗(yàn)方法示意圖。
i. 來(lái)自對(duì)照組（n=3）和AE-F2胰島（n=4）的轉(zhuǎn)錄組主成分分析（PCA）。
j. 與對(duì)照組相比，AE-F2胰島中差異上調(diào)和下調(diào)基因的數(shù)量。
k. F2代胰島轉(zhuǎn)錄組和F1代精子甲基化組共有的前10條富集的KEGG通路。
（5）從AE-F1精子持續(xù)到AE-F2胰島的DNA甲基化變化抑制β細(xì)胞功能基因表達(dá)
圖5：從AE-F1精子持續(xù)到AE-F2胰島的異常DNA甲基化導(dǎo)致β細(xì)胞功能基因表達(dá)異常。
a. F2代胰島中727個(gè)DEGs和F1代精子中8571個(gè)DMRs基因維恩圖，其中296個(gè)基因重疊。b. 通過(guò)對(duì)a中296個(gè)重疊基因進(jìn)行KEGG富集分析確定的前10條通路。
c. 對(duì)296個(gè)在WGBS和RNA-seq數(shù)據(jù)集中共同變化基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，分析這些基因所富集的通路。
d. 在b和c中鑒定出的胰島素分泌通路中的基因列表。它詳細(xì)列出了基因功能、AE-F1精子中胰島素分泌基因的差異甲基化水平以及AE-F2胰島中基因表達(dá)變化。
e. 通過(guò)MeDIP-qPCR分析Ctrl-F1和AE-F1精子中Pdx1、Irs1、Ptprn2和Cacna1c的DNA甲基化水平（n=3）。
f. 通過(guò)MeDIP-qPCR分析Ctrl-F2和AE-F2 E18.5胰腺中Pdx1、Irs1、Ptprn2和Cacna1c的DNA甲基化水平（n=3）。
g. 通過(guò)MeDIP-qPCR分析Ctrl-F2（n=4）和AE-F2成年胰島中Pdx1、Irs1、Ptprn2和Cacna1c的DNA甲基化水平（n=5）。
h. 通過(guò)qRT-PCR分析Ctrl-F2（n=4）和AE-F2成年胰島中Pdx1、Irs1、Ptprn2和Cacna1c的mRNA表達(dá)水平（n=5）。
i. 通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)分析Ctrl-F2和AE-F2成年小鼠胰島中PDX1、IRS1、PTPRN2和CACNA1C的蛋白水平。
j. F1至F3代精子中胰島素分泌基因的甲基化譜。水平線上的垂直條表示單個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平（0-1）。方框表示啟動(dòng)子或genebody區(qū)域中的DMR。
（6）AE-F1精子和2型糖尿�。═2D）患者的共有甲基化特征在AE母親所生男孩的血液中得到驗(yàn)證
圖6：AE-F1精子、T2D患者以及母體雄激素水平異常女性所生男孩血液中共同的DNA甲基化變化
a. 精子WGBS和已發(fā)表的T2D受試者DNA甲基化數(shù)據(jù)相交的基因數(shù)量UpSet圖。b. F1代精子WGBS、T2D患者胰島和T2D患者血液研究（Fraszczyk等人的研究）中共同的甲基化基因Venn網(wǎng)絡(luò)圖。
c. F1代精子WGBS、T2D患者胰島和T2D患者血液研究（Cardona等人的研究）中共同的甲基化基因Venn網(wǎng)絡(luò)圖。
d. F1代精子WGBS、T2D患者胰島和T2D患者血液研究（Relloso等人的研究）中共同的甲基化基因Venn網(wǎng)絡(luò)圖。
e. MeDIP-qPCR分析了對(duì)照組兒子（n=20）和母體雄激素水平異常的男孩（n=20）血液中的DNA甲基化水平。
（7）節(jié)食（CR）和二甲雙胍（Met）改善了AE-F1雄性的代謝功能障礙，并阻斷了這些功能障礙向后代傳遞
圖7：節(jié)食和二甲雙胍改善AE-F1雄性小鼠的代謝功能障礙，并阻斷其向后代傳遞
a. F1代雄性后代的節(jié)食（CR）和二甲雙胍（Met）干預(yù)示意圖。b. 經(jīng)過(guò)相應(yīng)干預(yù)后F1代雄性小鼠在禁食6小時(shí)后的血糖水平。
c. 經(jīng)過(guò)相應(yīng)干預(yù)后F1代雄性小鼠進(jìn)食后的血糖水平。
d. 經(jīng)過(guò)相應(yīng)干預(yù)后F1代雄性小鼠的腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）及相關(guān)曲線下面積。
e. 經(jīng)過(guò)相應(yīng)干預(yù)后F1代雄性小鼠的胰島素耐受性試驗(yàn)（ITT）及相關(guān)曲線下面積。
f. 經(jīng)過(guò)干預(yù)的F1代雄性小鼠所生的F2代雄性后代在禁食6小時(shí)后的血糖水平。
g. 經(jīng)過(guò)干預(yù)的F1代雄性小鼠所生的F2代雄性后代進(jìn)食后的血糖水平。
h. 經(jīng)過(guò)干預(yù)的F1代雄性小鼠所生的F2代雄性后代的葡萄糖耐量試驗(yàn)及相關(guān)曲線下面積。
i. 經(jīng)過(guò)干預(yù)的F1代雄性小鼠所生的F2代雄性后代的胰島素耐受性試驗(yàn)及相關(guān)曲線下面積。
（8）節(jié)食和二甲雙胍恢復(fù)了雄性后代小鼠中異常的DNA甲基化和β細(xì)胞功能基因表達(dá)。
圖8：節(jié)食和二甲雙胍恢復(fù)了雄性后代小鼠中異常的DNA甲基化和β細(xì)胞功能基因表達(dá)。
a. MeDIP-qPCR分析對(duì)照組（Ctrl）、雄激素暴露組（AE）、AE-CR和AE-Met處理的F1代雄性小鼠精子中Pdx1、Irs1、kcnma1、Ptprn2、Cacna1c和Ptpn11的DNA甲基化水平（n=3）。b. 來(lái)自父本對(duì)照組（Ctrl）、AE、AE-CR和AE-Met處理的F2代雄性小鼠的代表性胰腺切片，用PDX1（紅色）、INSULIN（綠色）和DAPI（藍(lán)色）進(jìn)行染色。對(duì)胰島素陽(yáng)性β細(xì)胞中的PDX1熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析（n=3）。
c. 來(lái)自父本對(duì)照組（Ctrl）、AE、AE-CR和AE-Met處理的F2代雄性小鼠的代表性胰腺切片，用IRS1（紅色）、INSULIN（綠色）和DAPI（藍(lán)色）進(jìn)行染色。對(duì)胰島素陽(yáng)性β細(xì)胞中的IRS1熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析（n=3）。
d. 來(lái)自父本對(duì)照組（Ctrl）、AE、AE-CR和AE-Met處理的F2代雄性小鼠的代表性胰腺切片，用CACNA1C（紅色）、INSULIN（綠色）和DAPI（藍(lán)色）進(jìn)行染色。對(duì)胰島素陽(yáng)性β細(xì)胞中的CACNA1C熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析（n=3）。
e. 工作模型示意圖：母體AE使所生男孩易患β細(xì)胞功能障礙和DNA甲基化變化。在小鼠中，產(chǎn)前AE通過(guò)精子誘導(dǎo)DNA甲基化重編程，導(dǎo)致后代胰島胰島素分泌缺陷，從而在F1至F3代雄性后代中隨著年齡增長(zhǎng)和高脂飲食出現(xiàn)高血糖和葡萄糖耐受不良。節(jié)食（CR）和二甲雙胍（Met）干預(yù)恢復(fù)了葡萄糖穩(wěn)態(tài)，并阻斷高血糖向后代傳遞。
易小結(jié)
本研究通過(guò)WGBS和對(duì)應(yīng)的RNA-seq等分析揭示了母體雄激素暴露會(huì)通過(guò)精子DNA甲基化變化跨代傳遞胰島素分泌功能障礙，增加雄性后代患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。節(jié)食和二甲雙胍干預(yù)可有效改善這種代謝異常，并阻斷其跨代傳遞。這些發(fā)現(xiàn)為預(yù)防和治療代謝性疾病提供了新的策略和潛在的生物標(biāo)志物。
WGBS在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用
鑒定差異甲基化區(qū)域：通過(guò)WGBS，研究者在F1代精子中鑒定出大量與胰島素分泌相關(guān)的DMRs，為理解跨代遺傳機(jī)制提供了重要線索。
揭示跨代傳遞的分子基礎(chǔ)：WGBS結(jié)果顯示，這些甲基化變化在F2代胰島中持續(xù)存在，并影響相關(guān)基因表達(dá)，從而揭示了跨代遺傳的分子基礎(chǔ)。
評(píng)估干預(yù)效果：通過(guò)比較干預(yù)前后的WGBS數(shù)據(jù)，研究者發(fā)現(xiàn)CR和Met干預(yù)能部分恢復(fù)異常的DNA甲基化模式，從而評(píng)估了干預(yù)措施的潛在機(jī)制。
參考文獻(xiàn)：
Zhang Y, Hu S, Han S, Liu C, Liang X, Li Y, Lin Z, Qin Y, Geng C, Liu Y, Cui L, Hu J, Zhang C, Wang Z, Liu X, Ma J, Chen ZJ, Zhao H. Transgenerational inheritance of diabetes susceptibility in male offspring with maternal androgen exposure. Cell Discov. 2025 Feb 12;11(1):14. pii: 10.1038/s41421-025-00769-1. doi: 10.1038/s41421-025-00769-1.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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