實驗室PCR反應的污染的應對處理方法
PCR技術是一種體外模擬DNA復制過程的核酸擴增技術，主要通過重復高溫變性、低溫退火和延伸三個循環(huán)，然后將靶DNA擴增數(shù)百萬倍，因此PCR技術的優(yōu)勢就是極高的靈敏度，但是任何事物都有其兩面性，PCR技術最大的一個缺點就是—易污染，極其微量的污染都有可能導致假陽性的產(chǎn)生。一旦發(fā)生實驗室核酸污染，正常開展的實驗就必須要停止，然后花費大量物力、人力直到尋找污染源，或者實驗室清潔達標為止，而且實驗報告結(jié)果必須作廢，需重新實驗，結(jié)果才可靠。為了有效的避免污染，獲得穩(wěn)定可靠的檢驗結(jié)果，我們在實際的工作當中往往需要采用一定的措施來預防或者消除污染。
一、污染的來源：
1、試劑污染
由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣器、容器、水及其他溶液被核酸污染。
2、設備污染
半自動核酸提取儀、全自動核酸提取儀在提取過程導致濺灑樣本或者核酸模板，污染機器。或者設備內(nèi)垃圾筒清潔不徹底，殘留液體或結(jié)晶揮發(fā)形成氣溶膠對造成污染。
3、標本交叉污染
可能是由于收集標本的容器被污染，標本放置時由于密封不嚴溢于容器外，容器外黏有標本，吸樣器污染及空氣中的氣溶膠導致的標本間交叉污染。尤其是病毒類可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。
4、PCR擴增產(chǎn)物污染
這是PCR中最常見的污染問題，常見于需要在擴增后開蓋的檢測項目，或者是擴增后產(chǎn)物處理不當，因為PCR產(chǎn)物拷貝量大，遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染就可形成假陽性。
5、克隆質(zhì)粒的污染
在實驗室操作中經(jīng)常會用到陽性參考品，這些陽性參考品大多數(shù)是由某些用克隆質(zhì)粒制作而成，克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)濃度高，不小心使用極易造成污染。
有些實驗室自己克隆質(zhì)粒做質(zhì)控品，配制過程后，垃圾的處理方式不嚴格等，從而造成質(zhì)控品對實驗室的污染進而造成實驗室對標本的污染。
二、控制污染的措施：
1、實驗分區(qū)域
合理分隔實驗室。將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行，特別注意標本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應與其他步驟嚴格分開。
最好能劃分：標本處理區(qū)，PCR反應液制備區(qū)，PCR循環(huán)擴增區(qū)，PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實驗用品及吸樣槍應專用。
實驗前應將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的 DNA 或RNA.
2、各區(qū)物品不得混用
各個實驗區(qū)域要對不同設備、物品顏色有明顯的標記，如各區(qū)域使用專門的工作服、工作鞋、垃圾桶、拖把、抹布、筆等，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設備、物品混用。
使用一次性用具吸頭、離心管、無粉塵手套、口罩等
3、設置規(guī)范的空調(diào)通風系統(tǒng)
盡可能采用全送全排空調(diào)系統(tǒng)。在進入各個操作區(qū)域需要嚴格單一向進行，即試劑準備和貯存區(qū)→樣品制備區(qū)→ＰＣＲ擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)，不得逆行。
4、污染監(jiān)測
設立陽性對照、陰性對照，進行重復試驗，選擇不相同區(qū)域的引物進行ＰＣＲ擴增等，做好污染監(jiān)測，以便采取措施防止和消除污染。
5、定期實驗室清潔
配制含有效氯 0.5% 的消毒液對設備表面、臺面、地面、物品表面、傳遞窗內(nèi)及門窗進行擦拭，對設備內(nèi)垃圾桶進行浸泡。
根據(jù)從上到下、從里到外的原則進行酒精對空噴灑。
酒精擦拭（75%）移液器、八連管離心機、混勻振蕩器等小型設備。
純化水對設備表面、臺面、地面進行擦拭，對設備垃圾桶進行沖洗。
一、污染的來源：
1、試劑污染
由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣器、容器、水及其他溶液被核酸污染。
2、設備污染
半自動核酸提取儀、全自動核酸提取儀在提取過程導致濺灑樣本或者核酸模板，污染機器。或者設備內(nèi)垃圾筒清潔不徹底，殘留液體或結(jié)晶揮發(fā)形成氣溶膠對造成污染。
3、標本交叉污染
可能是由于收集標本的容器被污染，標本放置時由于密封不嚴溢于容器外，容器外黏有標本，吸樣器污染及空氣中的氣溶膠導致的標本間交叉污染。尤其是病毒類可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。
4、PCR擴增產(chǎn)物污染
這是PCR中最常見的污染問題，常見于需要在擴增后開蓋的檢測項目，或者是擴增后產(chǎn)物處理不當，因為PCR產(chǎn)物拷貝量大，遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染就可形成假陽性。
5、克隆質(zhì)粒的污染
在實驗室操作中經(jīng)常會用到陽性參考品，這些陽性參考品大多數(shù)是由某些用克隆質(zhì)粒制作而成，克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)濃度高，不小心使用極易造成污染。
有些實驗室自己克隆質(zhì)粒做質(zhì)控品，配制過程后，垃圾的處理方式不嚴格等，從而造成質(zhì)控品對實驗室的污染進而造成實驗室對標本的污染。
二、控制污染的措施：
1、實驗分區(qū)域
合理分隔實驗室。將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行，特別注意標本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應與其他步驟嚴格分開。
最好能劃分：標本處理區(qū)，PCR反應液制備區(qū)，PCR循環(huán)擴增區(qū)，PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實驗用品及吸樣槍應專用。
實驗前應將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的 DNA 或RNA.
2、各區(qū)物品不得混用
各個實驗區(qū)域要對不同設備、物品顏色有明顯的標記，如各區(qū)域使用專門的工作服、工作鞋、垃圾桶、拖把、抹布、筆等，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設備、物品混用。
使用一次性用具吸頭、離心管、無粉塵手套、口罩等
3、設置規(guī)范的空調(diào)通風系統(tǒng)
盡可能采用全送全排空調(diào)系統(tǒng)。在進入各個操作區(qū)域需要嚴格單一向進行，即試劑準備和貯存區(qū)→樣品制備區(qū)→ＰＣＲ擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)，不得逆行。
4、污染監(jiān)測
設立陽性對照、陰性對照，進行重復試驗，選擇不相同區(qū)域的引物進行ＰＣＲ擴增等，做好污染監(jiān)測，以便采取措施防止和消除污染。
5、定期實驗室清潔
配制含有效氯 0.5% 的消毒液對設備表面、臺面、地面、物品表面、傳遞窗內(nèi)及門窗進行擦拭，對設備內(nèi)垃圾桶進行浸泡。
根據(jù)從上到下、從里到外的原則進行酒精對空噴灑。
酒精擦拭（75%）移液器、八連管離心機、混勻振蕩器等小型設備。
純化水對設備表面、臺面、地面進行擦拭，對設備垃圾桶進行沖洗。
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