凝膠檢測作為經(jīng)典的細菌內毒素檢測方法，自20世紀70年代起便在醫(yī)藥領域廣泛應用。1980年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）率先制定相關指導原則，隨后美國藥典（USP）也將其納入標準，使其成為法定檢測方法。

USP<85>明確規(guī)定：“當測定結果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠限度法結果為準”，確立了凝膠檢測在細菌內毒素檢測中的重要地位。
 

一、凝膠檢測方法操作概述
在實際操作中，首先要制備內毒素標準系列，所需材料包括內毒素控制標準品（CSE）、無熱原水（LRW）和LAL試劑。LAL試劑的靈敏度（λ）是關鍵參數(shù)，通常標注在分析證書（CoA）和試劑小瓶上。測試標準曲線的稀釋倍數(shù)一般設為2λ、λ、0.5λ和0.25λ，且標準曲線只有在λ的2倍稀釋范圍內呈現(xiàn)陽性結果才有效。

具體測試時，將100µL的產(chǎn)品稀釋液與100µL的LAL試劑等量混合。陽性產(chǎn)品對照需通過將產(chǎn)品稀釋后接種至2λ內毒素水平來制備，同時要設置未接種稀釋液（如LRW）作為陰性對照。

混合后的試管在37°C環(huán)境下孵育60分鐘±2分鐘。孵育結束后，輕輕取出試管并緩緩倒轉180°，觀察凝膠形成情況。若管內形成堅實凝膠，且不變形、不從管壁滑脫，則判定為陽性；反之則為陰性。整個保溫及拿取試管過程需避免振動，防止因振動導致凝膠破壞，出現(xiàn)假陰性結果。

二、BET計算
1、內毒素限值（L）計算
內毒素限值（L）的計算是細菌內毒素檢測的關鍵環(huán)節(jié)，其計算公式為：

其中，“K”表示人每千克體重或每平方米體表面積每小時最大可接受的內毒素劑量。不同類型注射劑的K值有所差異：

• 注射劑K=5EU/(kg·h)
• 放射性藥品注射劑K=2.5EU/(kg·h)
• 鞘內用注射劑K=0.2EU/(kg·h)
• 按體表面積給藥時K=100EU/(m²·h)​

“M”為人用每千克體重或每平方米體表面積每小時的最大供試品劑量，M值需結合最大給藥劑量、人均體重（美國70kg，中國及日本60kg）及注射時間（不足1小時按1小時計）來確定。

2、最大有效稀釋（MVD）計算

其中，L為內毒素限值，c為供試品溶液的濃度。

3、最小有效稀釋濃度（MVC）計算

其中，L為內毒素限值，λ為靈敏度。

4、標準系列的稀釋倍數(shù)計算

例如，重組CSE小瓶中含有50EU/mL，λ為0.125EU/mL。該計算方法通過已知內毒素濃度（50EU/mL）除以所需的內毒素值（20λ或2.5EU/mL）確定稀釋倍數(shù)，即需進行1:20稀釋以從重組CSE小瓶中獲得20λ標準液。

該溶液既可用于陽性對照制備（取10μL20λCSE加入100μL產(chǎn)品稀釋液形成2λ熱加標，此加標樣本應呈現(xiàn)陽性），也可進一步制備內毒素標準系列：從20λ稀釋液進行1:10稀釋得到2λ標準液，再通過1:2稀釋構建完整標準系列。

三、方法開發(fā)注意事項
凝膠檢測方法的開發(fā)需充分了解產(chǎn)品特性，包括溶解度、潛在干擾因素、內毒素限值、適用稀釋度以及pH范圍等，并與研發(fā)技術人員密切協(xié)作。

干擾篩查（抑制/增強）是方法開發(fā)的重要環(huán)節(jié)，通常通過MVD/MVC梯度稀釋（如1:2系列）來實施。

針對干擾問題，常用的解決方法是稀釋法。若稀釋法無法完全消除干擾，可通過調整pH至6-8（利用緩沖液或專用試劑）或消除葡聚糖干擾等方式解決。

四、方法驗證策略
驗證批次要求在方法驗證階段，通常使用三批產(chǎn)品進行商業(yè)產(chǎn)品方法驗證。對于臨床產(chǎn)品，若配方尚未定型，可采用單批次三次重復驗證的方式。

pH值控制驗證過程中，必須確保鱟試劑（LAL）與產(chǎn)品稀釋液混合后的pH值嚴格控制在6-8范圍內。若在驗證時需要調整pH值，后續(xù)常規(guī)檢測也必須采用相同的調整操作。

標準系列構建與有效性判定驗證時需同步構建產(chǎn)品標準系列和LRW內毒素標準系列。產(chǎn)品標準系列需在接種2λ內毒素后進行1:2梯度稀釋，直至λ、0.5λ、0.25λ濃度，各濃度及陰性對照（NPC）均需進行四次重復；LRW內毒素標準系列則進行兩次重復。有效性判定要求產(chǎn)品標準系列在2倍λ稀釋范圍內均呈陽性，以此確保標準系列的有效性和檢測方法的可靠性。

若檢測結果無效，需全面排查潛在因素，包括移液誤差、操作失誤、標準品效價不足、污染或稀釋錯誤等，及時糾正問題，重新進行檢測，直至獲得可靠的檢測結果。圖1展示了產(chǎn)品標準系列和LRW標準系列的試管設置，為驗證過程提供直觀參考。