該團(tuán)隊先前的研究揭示gga-miR-375在禽類白血病病毒J亞群(ALV-J)感染的雞肝臟腫瘤中表達(dá)顯著下調(diào)。結(jié)合當(dāng)下的研究熱點認(rèn)為gga-miR-375可能與circRNA有關(guān)。在本研究中，環(huán)狀RNA測序結(jié)果顯示，在感染ALV-J的雞肝臟腫瘤中，circ-Vav3顯著上調(diào)。進(jìn)一步通過RIP、生物素RNA pull down和RNA-FISH實驗證實circ-Vav3是gga-miR-375的海綿。此外，研究者通過雙熒光素酶報告基因檢測證實YAP1是gga-miR-375的靶基因，并且進(jìn)一步驗證了circ-Vav3通過海綿吸附作用釋放gga-miR-375的靶基因YAP1，進(jìn)而通過circ-Vav3/gga-miR-375/YAP1軸影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，并在臨床樣本中得到了驗證。

研究內(nèi)容：
1.circRNA表達(dá)譜及其結(jié)合位點預(yù)測

研究人員以ALV-J感染的雞肝為測序樣本，通過環(huán)狀RNA測序（由云序生物提供）檢測到有2822個circRNAs呈現(xiàn)差異性表達(dá)，其中2808個circRNAs顯著性上調(diào)。并通過聚類圖、火山圖和散點圖對25種表達(dá)上調(diào)的circRNAs進(jìn)行生信分析，發(fā)現(xiàn)circ-Vav3上調(diào)最顯著。此外，該團(tuán)隊先前的研究揭示了同樣的樣本中g(shù)ga-miR-375下調(diào)最明顯。接下來利用TargetScan和miRanda軟件對25種circRNAs可能結(jié)合的miRNAs進(jìn)行生信預(yù)測，結(jié)果顯示其中circ-Vav3與gga-miR-375結(jié)合的評分最高。

2.circ-Vav3海綿吸附gga-miR-375

circ-Vav3的命名主要是基于該環(huán)狀RNA來源于Vav3基因的8-11號外顯子；預(yù)測結(jié)果顯示circ-Vav3與gga-miR-375之間存在完美的靶向位點。利用海綿機制指示蛋白進(jìn)行AGO2 RIP實驗（由云序生物提供），對捕獲的AGO2蛋白進(jìn)行qPCR檢測發(fā)現(xiàn)circ-Vav3與gga-miR-375顯著富集；同時利用circ-Vav3探針進(jìn)行RNA pull down實驗（由云序生物提供）檢測出了gga-miR-375的結(jié)合情況。RNA-FISH實驗證實了circ-Vav3主要存在細(xì)胞質(zhì)，而gga-miR-375即存在于細(xì)胞質(zhì)又存在于細(xì)胞核，揭示了circ-Vav3和gga-miR-375通過相互結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用。

3.gga-miR-373 通過與YAP1的3’UTR區(qū)結(jié)合負(fù)調(diào)控YAP1的表達(dá)，并且過表達(dá)gga-miR-375可減弱EMT

生信預(yù)測揭示YAP1是gga-miR-375的潛在靶基因，進(jìn)一步的雙熒光素酶報告基因證實了gga-miR-375可通過結(jié)合YAP1的3’UTR區(qū)抑制YAP1的表達(dá)；在體外細(xì)胞系DF-1中過表達(dá)gga-miR-375可明顯下調(diào)YAP1的mRNA和蛋白水平，揭示了gga-miR-375通過直接結(jié)合YAP1的3’UTR區(qū)，抑制YAP1基因的表達(dá)。EMT現(xiàn)象是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的前兆，該過程伴隨著關(guān)鍵基因的上調(diào)（N-cadherin, Fibronectin, MMP2, ZEB1）和下調(diào)（E-cadherin）。通過過表達(dá)gga-miR-375發(fā)現(xiàn)可以顯著上調(diào)EMT正相關(guān)的基因的mRNA和蛋白水平，下調(diào)負(fù)相關(guān)基因的mRNA和蛋白水平，并且證明了EMT相關(guān)基因并不是gga-miR-375的直接靶基因。所以gga-miR-375是通過抑制YAP1基因的表達(dá)間接抑制EMT的進(jìn)程。

4.YAP1過表達(dá)促進(jìn)EMT，使細(xì)胞遷移能力增強

研究者進(jìn)一步通過Transwell實驗證明了過表達(dá)YAP1可顯著增強細(xì)胞的遷移能力，同時qPCR和WB也證實在YAP1過表達(dá)的DF-1細(xì)胞系中，EMT相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)情況發(fā)生了明顯的改變，說明YAP1可促進(jìn)EMT的發(fā)生和細(xì)胞遷移能力。

5.circ-Vav3海綿吸附gga-miR-375上調(diào)靶基因YAP1從而促進(jìn)EMT

經(jīng)過前期工作的積累，研究人員認(rèn)為circ-Vav3在胞漿中海綿吸附gga-miR-375，從而上調(diào)YAP1和EMT相關(guān)基因的表達(dá)。共表達(dá)實驗顯示，相對于過表達(dá)gga-miR-375和LCDH-circ-EV（空載組），而過表達(dá)gga-miR-375和LCDH-circ-Vav3（實驗組）的EMT正相關(guān)基因（Fibronectin, N-cadherin, MMP2, ZEB1和Vimentin）的蛋白和mRNA水平明顯上調(diào)，而負(fù)相關(guān)基因（E-cadherin）的蛋白和mRNA水平明顯下調(diào)；更加證實了circ-Vav3通過海綿作用吸附gga-miR-375，上調(diào)其靶基因YAP1的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。

6.ALV-J感染細(xì)胞系和臨床樣本的驗證

利用ALV-J病毒株感染DF-1細(xì)胞系后，利用WB和qPCR技術(shù)手段進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中circ-Vav3表達(dá)顯著上調(diào)，gga-miR-375表達(dá)顯著下調(diào)；同時，YAP1和EMT正相關(guān)基因的蛋白和mRNA水平也顯著的上調(diào)，相反的，EMT負(fù)相關(guān)基因的蛋白和mRNA水平則顯著下調(diào)。從養(yǎng)雞場獲取的感染ALV-J的雞的肝樣本，進(jìn)行相同的檢測，得到了相同的結(jié)果，進(jìn)一步夯實了整個實驗的結(jié)論。

總結(jié)：
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