免疫熒光（IF）實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程
免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique )又稱熒光抗體技術(shù)，免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來(lái)激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見(jiàn)熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。
免疫熒光實(shí)驗(yàn)操作步驟：
一、固定和透化
1. 在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的蓋玻片用1 × PBS浸洗3次，每次3 min。
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，1 × PBS浸洗玻片3次，每次3 min。
3. 0.5% Triton X-100(1× PBS配制 )室溫通透細(xì)胞15 min（細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟）, 1 × PBS浸洗玻片3次，每次3min。
二、封閉
4. 吸水紙吸干1 ×PBS，在玻片上滴加5%的正常血清（與二抗種屬來(lái)源一致或相似），室溫封閉1 h。
三、抗體孵育
5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4 ℃孵育過(guò)夜。
6. 加熒光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中37℃孵育1 h，PBST浸洗爬片3次，每次3 min。
注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行。
四、固定拍照
7. 復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。
8. 用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
免疫熒光實(shí)驗(yàn)操作步驟：
一、固定和透化
1. 在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的蓋玻片用1 × PBS浸洗3次，每次3 min。
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，1 × PBS浸洗玻片3次，每次3 min。
3. 0.5% Triton X-100(1× PBS配制 )室溫通透細(xì)胞15 min（細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟）, 1 × PBS浸洗玻片3次，每次3min。
二、封閉
4. 吸水紙吸干1 ×PBS，在玻片上滴加5%的正常血清（與二抗種屬來(lái)源一致或相似），室溫封閉1 h。
三、抗體孵育
5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4 ℃孵育過(guò)夜。
6. 加熒光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中37℃孵育1 h，PBST浸洗爬片3次，每次3 min。
注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行。
四、固定拍照
7. 復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。
8. 用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
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